Ứng dụng kĩ thuật phản ứng chuỗi polymerase và giải trình tự gene trong chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mủ nội nhãn nội sinh do vi khuẩn

Đề tài được tiến hành với mục tiêu nhằm bước đầu đánh giá hiệu quả của kĩ thuật polymerase (PCR) và giải trình tự gene trong chẩn đoán định danh vi khuẩn (VK) gây bệnh ở những mẫu bệnh phẩm lấy ở những bệnh nhân (BN) nghi ngờ viêm mủ nội nhãn nội sinh do VK (VMNNNSVK). Nghiên cứu mô tả không có đối chứng. Dùng kĩ thuật PCR và giải trình tự để phân tích 23 bệnh phẩm dịch kính ở 23 BN có triệu chứng lâm sàng điển hình của VMNNNSVK có so sánh với kết quả của nhuộm soi và nuôi cấy. Các thử nghiệm được tiến hành tại khoa Vi sinh, trường Đại học Gifu, Nhật Bản, tháng 1/2009.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Ứng dụng kĩ thuật phản ứng chuỗi polymerase và giải trình tự gene trong chẩn đoán định danh nguyên nhân viêm mủ nội nhãn nội sinh do vi khuẩn NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE TRONG CHẨN ĐOÁN ĐỊNH DANH NGUYÊN NHÂN VIÊM MỦ NỘI NHÃN NỘI SINH DO VI KHUẨN Đỗ Tấn*, Đỗ Như Hơn*, Phạm Hồng Nhung** TÓM TẮT Mục tiêu: Nhằm bước đầu đánh giá hiệu quả của kĩ thuật polymerase (PCR) và giải trình tự gene trong chẩn đoán định danh vi khuẩn (VK) gây bệnh ở những mẫu bệnh phẩm lấy ở những bệnh nhân (BN) nghi ngờ viêm mủ nội nhãn nội sinh do VK (VMNNNSVK). Phương pháp: Nghiên cứu mô tả không có đối chứng. Dùng kĩ thuật PCR và giải trình tự để phân tích 23 bệnh phẩm dịch kính ở 23 BN có triệu chứng lâm sàng điển hình của VMNNNSVK có so sánh với kết quả của nhuộm soi và nuôi cấy. Các thử nghiệm được tiến hành tại khoa Vi sinh, trường Đại học Gifu, Nhật Bản, tháng 1/2009. Kết quả: Kết quả nhuộm soi: 8/23 (34,8%) trường hợp (TH) cho kết quả âm tính, trong khi đó PCR dương tính ở tất cả các TH. Trên 10/23 (43,5%) nhuộm soi quan sát thấy nhiều loại VK, nhưng chỉ có 3 TH trong số này được khẳng định trên PCR, 7 TH còn lại giải trình tự chỉ cho kết quả của 1 loại VK. Kết quả nuôi cấy: nuôi cấy cho tỉ lệ dương tính thấp (3/23 – 13% ). 3 TH dương tính này đều trùng khớp với kết quả của PCR và giải trình tự sau này. PCR và giải trình tự cho thấy gần ½ (11/23) các TH là phế cầu (Streptococcus pneumoniae). Có 5 TH phát hiện nhiều loại VK nhưng do khó khăn về kĩ thuật, chúng tôi không làm được tách dòng để xác định từng loại VK. Các TH còn lại gồm: Enterococcus casseliflanis (1), Streptococcus sp (1), Staphylocuccus sp (1), S.heamolyticus (1), Bacillus sp (1), S. sciuri (1), Enterobacter hormaecher (1). Kết luận: PCR và giải trình tự cho kết quả định danh VK chính xác hơn nhuộm soi và nuôi cấy, giúp ích cho điều trị, đồng thời góp phần xác định ổ nhiễm trùng nguyên phát của bệnh VMNNNSVK. Từ khóa: Viêm mủ nội nhãn nội sinh, PCR, giải trình tự gene. I. ĐẶT VẤN ĐỀ VMNNNSVK là một bệnh lí viêm nhiễm nặng nề ở các mô và dịch nội nhãn do sự xâm nhập của vi khuẩn từ cơ quan khác qua đường máu đến mắt. Đây là một bệnh lí cấp cứu có thể gây tổn hại lớn về chức năng thị giác, thậm chí có thể phải bỏ nhãn cầu mặc dù đã được điều trị tích cực. Bệnh viện Mắt Trung ương, Khoa Vi sinh, Đại học Y Hà Nội * ** VK khi đến mắt (cơ quan đích) cần có điều kiện thuận lợi để phát triển. Điều kiện thuận lợi đó là sự suy giảm sức đề kháng của cơ thể. VMNNNS theo y văn thường gặp ở những BN suy giảm miễn dịch hoặc suy kiệt do các bệnh lí toàn thân. Tuy nhiên, trên thực tế lâm sàng ở Việt Nam, chúng tôi thường gặp VMNNNS trên những BN trẻ, khoẻ mạnh. Cho đến nay, vẫn chưa có lời giải thích thoả đáng cho hiện tượng lâm sàng này. Một trong những khó khăn gặp phải trong quá trình điều trị Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) 5 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC là chẩn đoán nguyên nhân của bệnh. Việc xác định tác nhân gây bệnh có tầm quan trọng to lớn, quyết định hiệu quả của quá trình điều trị và tiên lượng chức năng của bệnh. Cho đến nay, các xét nghiệm vi sinh kinh điển thường làm là nhuộm soi và nuôi cấy VK, nhưng tỉ lệ dương tính thấp thay đổi từ 21 – 63%. Điều này có thể được giải thích như sau: (1) BN thường nhập viện khá muộn sau khi đã được điều trị rất nhiều bằng kháng sinh trước đó (toàn thân và tại chỗ); (2) môi trường nuôi cấy chưa đạt chuẩn, hiện chưa có môi trường nuôi cấy yếm khí. Thực tế lâm sàng này cho thấy, nhu cầu thiết yếu của việc sử dụng một loại xét nghiệm khác có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, trả lời kết quả nhanh hơn. Từ 10 năm trở lại đây, nhiều tác giả trên thế giới đã thông báo về sử dụng kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction) và giải trình tự (sequencing) trong phân tích dịch nội nhãn lấy từ BN nghi ngờ VMNN. Kĩ thuật này có thể khắc phục được các nhược điểm của kĩ thuật phân lập và nuôi cấy kinh điển: (1) chỉ cần lượng bệnh phẩm ít; không đòi hỏi bệnh phẩm phải chứa sinh vật còn sống (nghĩa là phân tích được cả những bệnh phẩm của những BN đã được điều trị kháng sinh trước đó); trả kết quả khá nhanh (trong vòng khoảng 24 giờ sau khi lấy bệnh phẩm). II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng 23 bệnh phẩm dịch kính ở 23 BN (nằm điều trị tại khoa Glôcôm, Bệnh viện Mắt Trung ương từ tháng 4/2008 đến 11/2008) có triệu chứng lâm sàng điển hình của VMNNNSVK. 2. Phương pháp Nghiên cứu mô tả không có đối chứng. Dùng kĩ thuật PCR và giải trình tự để phân tích 23 bệnh phẩm dịch kính ở 23 BN, có so sánh với kết quả của nhuộm soi và nuôi cấy. Các thử nghiệm được tiến 6 Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) hành tại khoa Vi sinh, trường Đại học Gifu, Nhật Bản vào tháng 1/2009. Quy trình lấy bệnh phẩm: - Tất cả BN đều được lấy bệnh phẩm trong phòng mổ theo quy trình giống nhau. Sát khuẩn thường quy bằng povidone 5% và gây tê cạnh nhãn cầu bằng lidocaine 2%. - Bệnh phẩm dịch kính lấy bằng máy cắt dịch kính: trước khi mở đường tryền vào, hút bệnh phẩm qua đầ ...