ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES

sảy thai, thai chết lưu và đẻ non đối với phụ nữ mang thai, gây nhiễm trùng máu vàviêm màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém. Liều gây nhiễmcủa chúng rất thấp chỉ khoảng 102 CFU/g đối với người trưởng thành và 10 CFU/g đốivới trẻ em và phụ nữ mang thai [7, 8, 11, 13, 14, 16 và 17]. Ở các nước phát triển, L.monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát nghiêm ngặt trong quản lý chất lượngthực phẩm. Tuy nhiên tại Việt nam, chưa có tiêu chuẩn vệ sinh an...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES Nguyễn Thị Kim Hoa, Tô Kim Anh Viện Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà nội 1, Đại Cồ Việt, Hai Bà trưng Hà nội. Fax: 4 868 2452, tokimanh@mail.hut.edu.vn I. MỞ ĐẦU L. monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với những hậu quả trầm trọng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non đối với phụ nữ mang thai, gây nhiễm trùng máu và viêm màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém. Liều gây nhiễm của chúng rất thấp chỉ khoảng 102 CFU/g đối với người trưởng thành và 10 CFU/g đối với trẻ em và phụ nữ mang thai [7, 8, 11, 13, 14, 16 và 17]. Ở các nước phát triển, L. monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát nghiêm ngặt trong quản lý chất lượng thực phẩm. Tuy nhiên tại Việt nam, chưa có tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm nào kiểm soát tác nhân gây bệnh này và vì thế chưa có số liệu nào đề cập tình trạng nhiễm L. monocytogenes ngay cả đối với các thực phẩm không qua xử lý nhiệt và bảo quản lạnh dài ngày [1] Các phương pháp truyền thống phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bao gồm các bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và hàng loạt các thử nghiệm hoá sinh để khẳng định sự hiện diện của một loài gây bệnh nhất định, và thường kéo dài vài ngày đến vài tuần [3, 6, 8]. Trong những năm vừa qua, các phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt hơn nhằm phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA…đã được thiết lập. PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ khả năng phát hiện nhanh và đặc hiệu mầm bệnh. Các nghiên cứu hiện nay trên thế giới đang tập trung vào khẳng định khả năng sử dụng PCR như phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh thực phẩm [4, 8 và 11]. Với mục tiêu góp phần kiểm soát an toàn thực phẩm, trong bài viết này, chúng tôi trình bày các khảo nghiệm xây dựng quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F LM-R như một công cụ kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm này. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi sinh vật Quy trình phát hiện được xây dựng trên chủng L. monocytogenes 0704 do phòng thí nghiệm vi sinh vật ENSAT, Trường Đại học Bách khoa Toulouse, Pháp cung cấp. Các chủng thử nghiệm khác được dẫn ra trong bảng 1. Hoá chất Hoá chất sử dụng cho tách chiết DNA tổng số, hoá chất cho điện di trên gel agarose, thang DNA chuẩn 100 bp và 1000bp do Sigma cung cấp. Các hoá chất sử dụng cho phản ứng PCR do Amersham Phamacia Biotech cung cấp. Các hoá chất sử dụng cho phân tích trình tự gen (Kanamyxin, Xgal, Eco RI, bộ kit tách dòng Topo TA Cloning® Kit, bộ kit tách và tinh sạch plasmid QIA prep® Spin Miniprep Test Kit) do InvitrogenPDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com cung cấp, kit xác định trình tự BigDye Terminator v3.1 do Applied Biosystem cung cấp. Các hoá chất khác ở độ tinh khiết phân tích. Mồi cho phản ứng PCR Dựa trên các trình tự gen hlyA của các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên ngân hàng gen, cặp mồi LM-F và LM-R được thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp [2]. Xác định tính đặc hiệu của mồi Khả năng bắt cặp chính xác của mồi được khẳng định bằng cách phân tích trình tự sản phẩm PCR theo phương pháp của Sanger và cộng sự [15] và so sánh với trình tự các gen đích hlyA của các L. monocytogenes theo phần mềm BLAST. Tính đặc hiệu của mồi được khảo sát bằng cách kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi thiết kế với các khuôn DNA của vi khuẩn L. monocytogenes và không phải L. monocytogenes trong phản ứng PCR. Phản ứng PCR DNA khuôn từ L. monocytogenes 0704 được thu nhận cho phản ứng PCR bằng cách tách và làm sạch DNA với chloroform [4] hoặc xử lý nhiệt tế bào ở 1000C trong 10 phút. Tối ưu hoá điều kiện PCR về nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi (0,1 - 0,5 pmol/mồi) và nồng độ dNTPs (100 - 250 µM/mỗi loại). Phản ứng PCR được thực hiện với thể ...