Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR

Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCRPCR machine PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCRThe PCR technique was patented by CetusCorporation, where Mullis worked when heinvented the technique. The Taq polymeraseenzyme is also covered by patents. There have beenseveral high-profile lawsuits related to thetechnique, including most famously a lawsuitbrought by DuPont. The pharmaceuticalcompany Hoffmann-La Roche purchased the rightsto the patents in 1992 and currently holds them.Thực nghiệm PCRFigure 1: PCR machinePCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNAngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là mộtgen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vậtsống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNAngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair =kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợiđôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọilà cặp base. Một vài phương pháp có thể copy mộtmảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so vớinhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụnhư tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base.Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiềuthành phần. Những thành phần đó là: - DNA mẫu(template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặpmồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúcvùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi) -DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lêncủa DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyênliệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới.- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học choDNA-polymerasePhản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt.Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phảnứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Đểngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phầnnắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trườnghợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta chomột lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợpphản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD.Đoạn mồiĐoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồichọn lọc. Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhântạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vìDNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xácđịnh bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợiđơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phùhợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúccủa DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNAmẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi màDNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợpcủa sợi DNA mới.Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi vànhiệt độ biến tính của nó (Tm-melting) phụ thuộcvào số … Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầmlẫn với nhiệt độ biến tính của DNA trong chu kỳđầu tiên của quá trình PCR -- được định nghĩa lànhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệtđộ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệt độbiến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồiquá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài vàsẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dàiDNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệtđộ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80°C sẽ gây ranhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ởnhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ60 – 75°C.Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũngđược sử dụng. Những đoạn mồi này là hỗn hợptương tự nhưng không giống hoàn toàn. Nó có thểthuận tiện nếu có cùng gen cần khuếch đại từnhững sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó cóthể là tương tự nhưng không giống nhau. Người tacòn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồiđược thiết kế dựa trên chuỗi protein. Như nhiềucodon có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thườngrất khó để suy ra codon nào dùng cho trường hợpđặc biệt. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit aminisoleucine có thể là “ATH”, A có nghĩa là adenine,T là thymine, và H ứng với adenine, thymine, haycytosine. (Xem mã di truyền để hiểu them vềcodons) Sử dụng đoạn mồi đã thoái hóa có thể làmgiảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấnđề có thể được giải quyết bằng phương pháptouchdown PCR.Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ởtrên cần phụ thuộc vào sản xuất sản lượng: - hàmlượng GC nên trong khoảng 40-60% - Tính toánnhiệt biến tính cho cả những đoạn mồi trong phảnứng không khác quá 50°C và nhiệt biến tính củasản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 10°C -Nhiệt độ bám vào thỉnh thoảng thấp hơn nhiệt nóngchảy 50°C. Tuy nhiên, nên chọn lựa theo kinhnghiệm cho từng trường hợp cụ thể. - Tránh … -Kết thúc đầu 3’ rất nhạy cảm – nó có thể không bổsung cho bất cứ vùng nào của đoạn mồi trong phảnứng và phải cung cấp base chính xác phù hợp vớimẫu. Có cả chương trình hỗ trợ việc thiết kế mồi(xem External links) Quy trìnhQuy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳgồm 3 bước (Hình 2)(1)Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNAra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nốihydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNAthường được biến tính đến thời gian mở chuỗi đểđảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàntoàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút(2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ đượ ...