Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân ung thư võng mạc

Phát hiện đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư võng mạc là tiền đề quan trọng giúp phát hiện người lành mang bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa ở trẻ. Đột biến trên gen RB1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở một số exon trọng điểm trong đó có exon 10, 14, 20. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 trên exon 10, 14, 20. 49 bệnh nhân ung thư võng mạc được lựa chọn nghiên cứu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân ung thư võng mạcTẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCXÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN MỘT SỐ EXON TRỌNG ĐIỂMCỦA GEN RB1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÕNG MẠCVũ Đức Anh1, Trần Huy Thịnh1, Phạm Trọng Văn1,2,Phạm Hồng Vân2, Tạ Thành Văn1, Trần Vân Khánh11Trường Đại học Y Hà Nội; 2Bệnh viện Mắt Trung ươngUng thư võng mạc là một trong những khối u ác tính thường gặp nhất tại ổ mắt ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ,bệnh gây nên do đột biến gen RB1 làm mất hoặc giảm chức năng của protein RB1. Ở nước đang phát triểnnhư Việt Nam, phần lớn các trường hợp đều phát hiện muộn và trẻ thường phải khoét bỏ nhãn cầu, thậm chíđe dọa tính mạng của trẻ. Phát hiện đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư võng mạc là tiền đề quantrọng giúp phát hiện người lành mang bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa ởtrẻ. Đột biến trên gen RB1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở một số exon trọng điểm trong đó có exon10, 14, 20. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 trên exon 10, 14, 20. 49bệnh nhân ung thư võng mạc được lựa chọn nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen được áp dụng để xácđịnh đột biến điểm trên exon 10, 14 và 20. 5/49 (10,2%) bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, trong đó 1bệnh nhân phát hiện đột biến p.Trp680Cys và 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile trênexon 20, 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Tyr452Phe trên exon 14, và 1 bệnh nhân phát hiện 2 đột biến:p.Tyr452Phe và p.Val455Glu trên exon 14. Bệnh nhân còn lại phát hiện đột biến p.Thr345Arg frameshift X6trên exon 10. Tất cả các đột biến đều là đột biến dị hợp và là đột biến chưa từng được công bố.Từ khóa: Ung thư võng mạc, gen RB1, đột biến genI. ĐẶT VẤN ĐỀUng thư võng mạc là một bệnh lý ác tínhGần 40% đột biến gen RB1 tái diễn và tậpthường gặp nhất tại ổ mắt ở trẻ sơ sinh và trẻtrung tại 16 điểm bao gồm 12 đột biến vônhỏ, với tần suất thường gặp từ 1/15.0001/18.000 trẻ được sinh ra, bệnh liên quan tớinghĩa (nonsense), 02 đột biến sai nghĩađột biến ở gen RB1 [1 - 3]. Đột biến gây bệnhtrên gen RB1 làm giảm hoặc thậm chí mấtNhững đột biến còn lại nằm rải rác dọc genchức năng của protein pRB, từ đó dẫn tới mấtkiểm soát quá trình nhân lên của tế bào, dẫn14, 17, 18, 20 và 23 [2 - 6]. Việc phát hiện ratới mất khả năng kiểm soát phân bào và hìnhvà triển khai các kỹ thuật sinh học phân tửthành khối u tại võng mạc [4].phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, đồng thờiCác nghiên cứu đã công bố có trên 900đột biến gen RB1 là cơ sở dữ liệu quan trọngcho tư vấn di truyền và cho biết đặc điểm giữamối quan hệ kiểu gen và kiểu hình của bệnh.Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứuGen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội(missense), 03 đột biến vị trí nối (splicing).RB1 và tỷ lệ gặp cao nhất ở các exon 9, 10,đột biến gen RB1 là cơ sở cho việc phát triểnquản lý tốt những người mang gen nhằm giảmtỷ lệ biến chứng và tỷ lệ tử vong ở trẻ [7 - 9].Ung thư võng mạc là một bệnh lý hiếmgặp, tuy nhiên số lượng bệnh nhân tới khámvà điều trị tại Bệnh viện Mắt Trung ương ngàycàng tăng. Năm 2005 chỉ có 14 bệnh nhânEmail: tranvankhanh@hmu.edu.vnđược phát hiện và chẩn đoán trong vòng 1Ngày nhận: 18/9/2018năm, tuy nhiên tới năm 2013 con số đó đãNgày được chấp thuận: 11/10/2018tăng lên 52 trẻ tới khám và điều trị [10].TCNCYH 115 (6) - 20181TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌCỞ Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đếnung thư võng mạc còn rất ít, chủ yếu là các72oC/30 giây], 72oC/5 phút. Bảo quản mẫu ở10oC.nghiên cứu về lĩnh vực lâm sàng nên cácKỹ thuật giải trình tự gen: các sản phẩmnghiên cứu về gen liên quan tới ung thư võngPCR sẽ được tiến hành giải trình tự trực tiếpmạc còn chưa nhiều, thông tin còn hạn chế.trên máy ABI 3100 Genetic Analyzer. Kết quảXuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hànhđược thu thập và xử lý bằng phần mềm ABInghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu xác định độtPRISMbiến trên một số exon trọng điểm của gen RB1Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI.ở bệnh nhân ung thư võng mạc.Trình tự được so sánh trên ngân hàng gen:II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPDNA (NG_009009.1) bằng phần mềm CLC.TM3100 – Avant Data Collection, DNA3. Đạo đức nghiên cứu1. Đối tượng49 bệnh nhân được chẩn đoán ung thưNghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạođức nghiên cứu trong Y học. Bệnh nhân vàvõng mạc tại Bệnh viện Mắt Trung ương dựagia đình bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện thamtrên lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh hoặcgia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏinghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục thamcó kết quả giải phẫu bệnh là ung thư võngmạc, bệnh nhân và gia đình đồng ý tham gianghiên cứu.gia. Bệnh nhân và gia đình được thông báo vềkết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác2. Phương phápsỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồđiều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân được- Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạchđảm bảo bí mật.chống đông bằng EDTA.- Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNAtổng số được tách chiết từ máu toàn phầnbằng phenol-chloroform-isopropanol (25:24:1).III. KẾT QUẢ1. Kết quả xác định khuếch đại exon 10,14 và 20 của gen RB1khuếch đại exon 10, 14 và 20 của gen RB1Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 10, 14và 20 của gen RB1 để khuếch đại DNA sauvới 3 cặp mồi được thiết kế.tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân. Hình 1 là- Kỹ thuật PCR: PCR được sử dụng để- Thành phần phản ứng PCR (thể tích20µl) gồm: nước cất PCR 11,9 µl; buffer 10X2,0 µl; 2,5 mM dNTP, 0,5 µM mồi xuôi vàngược, 0,5U Taq polymerase, 3,0µl DNA.oChu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94 C/5phút, 35 chu kỳ [94oC/30 giây, 55oC/30 giây,2hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 10của gen RB1.Sản phẩm PCR thu được chỉ có 1 băngđặc hiệu, rõ nét, kích thước 291 bp không cósản phẩm phụ. Sản phẩm khuếch đại PCRđảm bảo cho phản ứng giải trình tự tiếp theođể phát hiện đột biến điểm (hình 1).TCNCYH 115 (6) - 2018TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU ...