Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phầm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real time PCR vùng 5' NC để làm xét nghiệm định kiểu gen HCV

Nghiên cứu thực hiện xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA trên vùng 5’-NC của HCV, phân tích các kết quả và rút ra các kinh nghiệm chủ yếu. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phầm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real time PCR vùng 5’ NC để làm xét nghiệm định kiểu gen HCV Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học ÁP DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẦM PCR THU NHẬN ĐƯỢC TỪ THỬ NGHIỆM RT REAL-TIME PCR VÙNG 5’-NC ĐỂ LÀM XÉT NGHIỆM ĐỊNH KIỂU GEN HCV Nguyễn Thanh Bảo*, Phạm Hùng Vân* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Xét nghiệm HCV genotype là xét nghiệm mà các bác sĩ lâm sàng cần xác định trước khi bắt đầu điều trị bệnh nhân nhiễm HCV để có thể quyết định thời gian điều trị. Có nhiều phương pháp để xác định genotype HCV, tuy nhiên tiêu chuẩn nhất và hữu dụng lâm sàng nhất vẫn là giải trình tự vùng 5’NC. Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA trên vùng 5’-NC của HCV, phân tích các kết quả và rút ra các kinh nghiệm chủ yếu. Vật liệu và phương pháp: Các mẫu huyết thanh sau khi thu thập sẽ được tách chiết RNA cùng với RNA chứng nội tại được cho vào mẫu và tổng hợp thành cDNA từ dịch ly trích này. Thực hiện phản ứng real-time PCR dùng mồi và các đoạn dò Taqman đặc hiệu định lượng HCV có trong mẫu ban đầu. Tiến hành giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại này, so sánh với ngân hàng gene để định các subtype của HCV. Phân tích các kết quả và rút các kinh nghiệm chủ yếu. Kết quả: Từ tháng 1/2007 đến tháng 5/2008, tác giả đã áp dụng kỹ thuật này để định kiểu gene HCV cho 2000 trường hợp với kết quả ghi nhận được: 58% thuộc subtype 1b, 8% thuộc subtype 1a, 5% thuộc subtype 1c, 10% thuộc subtype 2a, 0,4% thuộc subtype 2b và 17% thuộc subtype 6a. Kết luận: Từ kết quả trên chúng ta nhận thấy các bệnh nhân nhiễm HCV ở Việt Nam hầu hết đều tập trung vào subtype 1b và 6a. Trong nghiên cứu này, tác giả đã đưa ra được kỹ thuật tốt nhất để vừa định lượng, vừa định type trên cùng một sản phẩm khuếch đại có chứa hỗn hợp DNA đích và DNA chứng nội tại, đồng thời chứa cả hệ thống chống ngoại nhiễm mà không làm ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng của xét nghiệm. Một ưu điểm nữa của phương pháp giải trình tự là có thể cho kết quả phân biệt được từng loại subtype trong khi các phương pháp khác sẽ có một tỉ lệ không cho subtype hay thậm chí không phân biệt được subtype. ABSTRACT APPLY THE DIRECT SEQUENCING OF THE QPCR PRODUCTS TO DO THE HCV GENOTYPING. Nguyen Thanh Bao, Pham Hung Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 243 - 248 Background: HCV genotyping is one of the testing that the physicians need to indicate before dicide the specific treatment on the HCV infected patients. There are many methods for HCV genotyping, however, the most effective and sensitive is the direct sequencing of the PCR product specific the 5’-NC of the virus. Objective: Set up the techniques for genotyping of HCV by direct sequencing the qPCR product specific to 5’-NC of viral genome, and carry out the analysis of the results and the outcome experiences. Materials and methods: The collected patients sera were added with the RNA-internal control and then were extracted the total RNA which were carried out the cDNA synthesis. The qPCR using specific * Bộ môn Vi Sinh, Đại Học Y Dược TP. HCM 242 Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 13 * Phụ bản của Số 1 * 2009 Nghiên cứu Y học primers and taqman probes were done to quantify the RNA-HCV copies in the samples. The qPCR products were sequenced and the collected sequences were aligned to the library of HCV genotype sequences to get the results of HCV genotyping. Results: From 1/2007 to 5/2008, authors applied these techniques on 2000 samples and the analysed results revealed that: 58% were belong to subtype 1b, 8% belong to subtype 1a, 5% belong to subtype 1c, 10% belong to subtype 2a, 0.4% belong to subtype 2b and 17% belong to subtype 6a. Conclusions: The received results demonstrated that most of the HCV infected patients in Viet Nam are infected with genotype 1b and 6a. In this study, the authors have proved that this testing will not only do the quantity but also do the genotyping of the HCV by direct sequencing of the qPCR products which contain the target sequence DNA. Another advantage of this testing is the internal control products and build-in contamination system did not influence to the sequencing results. Besides that, sequencing always results the subtype while other methods will give a low ratio or even can not differentiate the subtype of HCV. nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí ĐẶT VẤNĐỀ nghiệm NK-Biotek với yêu cầu định lượng và Trước khi chỉ định điều trị đặc hiệu, xét định kiểu gene HCV. Để phát hiện và định nghiệm định lượng và định kiểu gene virus lượng được HCV-RNA, phòng thí nghiệm sử viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm là một dụng bộ thử nghiệm RT TQ real-time PCR xét nghiệm tối cần thiết mà bác sĩ phải chỉ định (reverse transcriptase real-time PCR dùng cho bệnh nhân(8). Phương pháp lai trên vạch taqman probe) do công ty Nam Khoa sản x ...