Áp dụng kỹ thuật SSCP (single strand conformation polymorphism) để phát hiện đột biến trên gen pbp2b ở các chủng streptococcus pneumoniae kháng penicillin

Ðề tài áp dụng kỹ thuật SSCP để phát hiện đột biến trên 3 trình tự của gene pbp2b ở các chủng S. pneumoniae kháng penicillin. Trước hết, chúng tôi xác định một số chỉ tiêu của kỹ thuật để đạt độ phân tích tốt nhất cho các trình tự đã nêu. Các chỉ tiêu này bao gồm: tác nhân biến tính, hàm lượng DNA, nồng độ gel polyacrylamide, phương pháp nhuộm). Sau đó áp dụng quy trình với các chỉ tiêu đã xác định được để phát hiện đột biến trên 20 chủng kháng penicillin so sánh với chủng nhạy. Kết quả cho thấy 18/20 chủng khảo sát có mang đột biến ít nhất trên 1 trong 3 trình tự. Hai chủng kháng còn lại không cho thấy có sự khác biệt với chủng nhạy, có thể do đột biến nằm ngoài khu vực khảo sát hoặc do độ nhạy của kỹ thuật.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Áp dụng kỹ thuật SSCP (single strand conformation polymorphism) để phát hiện đột biến trên gen pbp2b ở các chủng streptococcus pneumoniae kháng penicillinY Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 6* Soá 2* 2002Nghieân cöùu Y hoïcAÙP DUÏNG KYÕ THUAÄT SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATIONPOLYMORPHISM) ÑEÅ PHAÙT HIEÄN ÑOÄT BIEÁN TREÂN GEN PBP2BÔÛ CAÙC CHUÛNG STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE KHAÙNG PENICILLINÑoã Thanh Ngaân1, Hoà Huyønh Thuøy Döông 2, Voõ Thò Chi Mai3TOÙM TAÉTStreptococcus pneumoniae khaùng penicillin laø vaán ñeà lôùn, mang tính toaøn caàu trong lónh vöïc söùc khoûecon ngöôøi. Cô cheá khaùng chuû yeáu döïa treân söï bieán ñoåi caáu truùc caùc PBP (Penicillin Binding Protein) maøquan troïng nhaát laø PBP1A, 2B, 2X maõ hoùa bôûi caùc gene pbp töông öùng. Kyõ thuaät SSCP (Single StrandConformation Polymorphism – Tính ña hình trong caáu hình maïch ñôn cuûa nucleic acid) laø moät trong nhöõngkyõ thuaät thoâng duïng cho pheùp phaùt hieän söï toàn taïi cuûa caùc ñoät bieán ñieåm treân moät trình töï nucleic acid khiso saùnh vôùi trình töï chuaån (khoâng mang ñoät bieán). Ñeà taøi aùp duïng kyõ thuaät SSCP ñeå phaùt hieän ñoät bieán treân3 trình töï cuûa gene pbp2b ôû caùc chuûng S. pneumoniae khaùng penicillin.Tröôùc heát, chuùng toâi xaùc ñònh moät soá chæ tieâu cuûa kyõ thuaät ñeå ñaït ñoä phaân tích toát nhaát cho caùc trình töïñaõ neâu. Caùc chæ tieâu naøy bao goàm: taùc nhaân bieán tính, haøm löôïng DNA, noàng ñoä gel polyacrylamide,phöông phaùp nhuoäm). Sau ñoù aùp duïng quy trình vôùi caùc chæ tieâu ñaõ xaùc ñònh ñöôïc ñeå phaùt hieän ñoät bieán treân20 chuûng khaùng penicillin so saùnh vôùi chuûng nhaïy. Keát quaû cho thaáy 18/20 chuûng khaûo saùt coù mang ñoätbieán ít nhaát treân 1 trong 3 trình töï. Hai chuûng khaùng coøn laïi khoâng cho thaáy coù söï khaùc bieät vôùi chuûng nhaïy,coù theå do ñoät bieán naèm ngoaøi khu vöïc khaûo saùt hoaëc do ñoä nhaïy cuûa kyõ thuaät.SUMMARYUSING SSCP (SINGLE S TRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) TECHNIQUE FOR DETECTIONOF MUTATION OF PENICILLIN-RESISTANT STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE PBP2B GENEÑoã Thanh Ngaân, Hoà Huyønh Thuøy Döông, Voõ Thò Chi Mai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 6 - No 2 - 2002: 70 - 73The spread of penicillin resistant strains of Streptococcus pneumoniae is an important worldwidehealth problem. Resistance is essentially based on the modification of PBPs (Penicillin Binding Proteins),particularly PBP1A, 2B and 2X, encoded by corresponding pbp genes. SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism) electrophoresis analysis is one of well-known techniques used to detect point mutations inDNA fragments. We used SSCP analysis for the detection of point mutations in 3 amplified fragments frompbp2b gene of resistant S. pneumoniae strains.Firstly, we determined some technical conditions of the SSCP protocol, including denaturation agents,DNA quantity, polyacrylamide gel concentration and staining procedure, to optimize the analysis ofinvestigated fragments. The protocol set up is used to detect point mutations in 20 penicillin-resistantstrains in comparison with the sensitive one. Results obtained showed the probable presence of pointmutations in at least 1 of the 3 fragments of 18/20 strains studied. The remaining 2 resistant strains showed1Cöû nhaân Sinh hoïc, Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân.Tieán só, boä moân Vi sinh-Sinh hoïc Phaân töû, Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân.3Tieán só, boä moân Vi sinh Khoa Y, khoa Vi sinh beänh vieän Chôï Raãy.2no difference in the electrophoretic pattern in comparison with the sensitive one, possibly due to thesensitivity of SSCP technique or to the absence of mutations in investigated region of pbp2b.70Nghieân cöùu Y hoïcMÔÛ ÑAÀUSöï phaùt trieån vaø lan truyeàn cuûa Streptococcuspneumoniae khaùng penicillin laø moät vaán ñeà quantroïng trong lónh vöïc chaêm soùc söùc khoûe treân theágiôùi. Taïi Vieät Nam, naêm 1999, theo soá lieäu cuûachöông trình Giaùm saùt quoác gia veà tính khaùngthuoác cuûa moät soá vi khuaån thöôøng gaëp, coù 13,7%chuûng S. pneumoniae ñöôïc xaùc ñònh laø khaùngpenicillin (treân 153 chuûng khaûo saùt). Tyû leä naøy laøcon soá ñaùng baùo ñoäng(4). Tình hình khaùng thuoáccuûa moät soá vi khuaån ôû ngöôøi khoûe maïnh taïi coängñoàng naêm 1999 (taïi ba ñòa ñieåm ngoaïi thaønh thaønhphoá Haø Noäi, Hueá vaø TP. Hoà Chí Minh) cho thaáy tæleä mang vi khuaån S. pneumoniae coù ñoäc löïc ôûngöôøi khoûe maïnh laø 40,1% taïi Haø Noäi, 16,7% taïiHueá vaø 30,9% taïi Tp. Hoà Chí Minh. Möùc ñoä nhaïycaûm vôùi penicillin cuûa 153 chuûng S. pneumoniae ôûtreû khoûe maïnh ñaõ giaûm ñi 19,6% tính chung choba ñòa phöông naøy(4).Nguyeân nhaân khaùng penicillin ôû S.pneumoniae laø do söï thay ñoåi cuûa caùc PBP(penicillin binding protein – phöùc hôïp enzym acylserine transferase xuùc taùc taïo caùc caàu peptidetrong hình thaønh thaønh teá baøo)(3). ÔÛ caùc chuûng S.pneumoniae khaùng penicillin, caùc PBP 1A, 2A, 2Bvaø 2X laø caùc PBP coù khaû naêng thay ñoåi giaûm aùilöïc vôùi penicillin. Trong ñoù, söï thay ñoåi cuûa PBP2B coù vai troø quan troïng. Hôn nöõa, gene pbp2bmaõ hoùa cho PBP 2B coù taàn soá ñoät bieán raát cao vaøñoät bieán xaûy ra treân gene pbp2b cuõng raát ñadaïng(1,2,3).Trong caùc phöông phaùp phaùt hieän söï toàn taïicaùc ñoät bieán treân moät trình töï DNA nhö: DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), CCM(Chemical Cleavage Method), EMC (EnzymeMismatch Cleavage),... thì kyõ thuaät SSCP (SingleStrand Conformation Polymorphism) laø kyõ thuaätkhaù thoâng duïng. Kyõ thuaät naøy cho pheùp phaân tíchtính ña hình cuûa caáu hình sôïi ñôn nucleic). Ñaây laømoät phöông phaùp ñôn giaûn ñeå xaùc ñònh ñoät bieánñieåm treân moät trình töï DNA khi so saùnh vôùi moättrình töï DNA ñaõ bieát. Nguyeân taéc cuûa kyõ thuaätnaøy laø trong ñieàu kieän ñieän di khoâng bieán tính, caùcmaïch ñôn DNA seõ coù moät caáu hình nhaát ñònh tuøyY Hoïc TP. Hoà Chí Minh * Taäp 6* Soá 2* 2002theo trình töï c ...