Bài giảng Công nghệ di truyền: Chương 1 - Nguyễn Vũ Phong

Bài giảng "Công nghệ di truyền - Chương 1: Các enzyme chủ yếu" cung cấp cho người học các kiến thức: Enzyme cắt giới hạn, Methyl hóa, Enzyme terminal transferase, phản ứng cắt bằng RE, DNA polymerase, DNA polymerase ở Prokaryote,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Công nghệ di truyền: Chương 1 - Nguyễn Vũ Phong Chương 1Các enzyme chủ yếu Nguyễn Vũ Phong Enzyme cắt giới hạn• Loại I: Cắt một đoạn vài chục nu cách vị trí nhận biết từ 1000 - 5000 nu.• Loại II: nhận biết trình tự chuyên biệt và cắt tại vị trí nhận biết• Loại III: Nhận biết trình tự và cắt cách trình tự nhận biết đó khoảng 20 nu Enzyme cắt giới hạn• RE cắt DNA ở vị trí chuyên biệt, có trình tự xác định Enzyme cắt giới hạnTrình tự nhận biết của 1 số enzym cắt hạn chếGắn các đoạn linkerEnzyme terminal transferase Isochizomer• MboI và Sau3AI nhận biết cùng trình tự• Trình tự nhận biết của BamHIMethyl hóa (methylation)EcoRI không cắt được Methyl hóa (methylation)• dam (DNA adenine methylase)• dcm (DNA cytosine methylase) Phản ứng cắt bằng RE• Buffer (dung dịch đệm) – (H): dung dịch đệm hoạt độ ion cao – (M): hoạt độ ion trung bình – (L): hoạt độ ion thấp Thường được chuẩn bị ở dạng stock (X10), giữ ở 4 0C/ 1-2 tuần; -20 0CPhản ứng cắt bằng REDNA polymerase• Tổng hợp chuỗi polymer từ các dNTP.• Gắn nucleotide vào đầu 3’-OH của primer có sẵn.• Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide ngay từ đầu mút của chuỗi (de novo)• Hầu hết các polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc từ các virus kí sinh vi khuẩn (thực khuẩn thể).DNA polymerase ở Prokaryote• Vi khuẩn: Pol I, Pol II, Pol III. – Tổng hợp polynucleotide theo 5’  3’. – Hoạt tính 3’  5’ exonuclease ứng dụng trong sửa sai (proofeading) – Pol I: sửa chữa DNA – Pol II: – Pol III: enzyme chính điều khiển quá trình tái bản.DNA polymerase I (từ E.coli) DNA Pol I còn có hoạt tính 5’  3’ exonuclease DNA polymerase ở Prokaryote• T4 DNA polymerase ở thực khuẩn thể cần khuôn và primer để hoạt động. 5’  3’ polymerase khi có dNTPs 3’ 5’ exonuclease khi không có dNTPs Không có hoạt tính 5’-3’ exonuclease Có thể sử dụng T4 DNA polymerase trong kỹthuật nick translation hay gắn nhãn đầu 3’ của DNAsợi đôi. DNA polymerase ở Prokaryote• DNA polymerase T7 của thực khuẩn thể là công cụ lí tưởng cho việc giải trình tự DNA. Dạng chỉnh sửa của enzyme này có tốc độ polymer hoá trên 300 nucleotide/giây. DNA polymerase ở Prokaryote• Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) xúc tác việc bổ sung homopolymer vào đầu 3’-OH của DNA và không cần khuôn mẫu. TdT được sử dụng trong dán nhãn DNA với các nucleotide đã biến đổi (ddNTP, DIG-dUTP), kéo dài primer hoặc giải trình tự DNA. DNA polymerase bền nhiệt• Bst : DNA Pol I, Bacillus stearothermophilus .• Bst Pol I hoạt động tốt nhất ở 65oC, bị bất hoạt ở 75oC/15’.• Hoạt tính 5’  3’ exonuclease đạt mức cao nhất khi có Mg2+ nồng độ cao.• Bst Pol I gồm 2 phân đoạn protein. Phân đoạn lớn bền nhiệt và rất hữu dụng trong các phản ứng giải trình tự ở 65 oC. DNA polymerase bền nhiệtTaq polymerase: Thermophilus aquaticus.Vi khuẩn sống ở 70 oC và có thể sống sót ở 80 oC.Taq polymerase có hoạt tính tối đa đạt được ở 80 oC vàcần Mg2+Thiếu hoạt tính 3’  5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai,proofreading), là enzyme có độ chính xác thấp. DNA polymerase bền nhiệtTth polymerase: Thermus thermophilus, 94 kDa, thiếuhoạt tính 3’  5’ exonuclease.- Xúc tác sao chép DNA: từ khuôn DNA với Mg2+, từ khuôn RNA (phiên mã ngược) với Mn2+