Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử - Nguyễn Thị Ngọc Yến

Chương này trình bày phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử. Các nội dung cụ thể được đề cập trong chương này gồm có: Công cụ cơ bản của sinh học phân tử và cách sử dụng, một số phương pháp cơ bản của sinh học phân tử, ứng dụng trong thực tế. Mời các bạn cùng tham khảo.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Sinh học phân tử: Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử - Nguyễn Thị Ngọc YếnPHƢƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SHPT GV: Nguyễn Thị Ngọc Yến Mục tiêu Công cụ cơ bản của SHPT và cách sử dụng Một số phương pháp cơ bản của SHPT Ứng dụng trong thực tếCác enzym biến đổi acid nucleic Enzym cắt hạn chế - RE Restriction enzyme (RE): Endonuclease cắt ADN tại hay gần 1 trình tự nhận diện đặc hiệu Methylase: methyl hóa trình tự nhận diện đặc hiệu và ngăn cản tác động RE Cặp RE/methylase khác nhau Phân loại RE Loại I và III là phức hệ gồm cả 2 hoạt tính RE và methyl hóa, loại này cần ATP và nó cắt ADN tại vị trí khá xa điểm nhận diện  ít được dùng Loại II chỉ có hoạt tính endonuclease, không cần ATP để hoạt động và cắt ADN tại hoặc rất gần vị trí nhận diện  sử dụng nhiều o EcoRII o BamHI… Nhận diện vị trí cắt Vị trí nhận diện của đa số RE loại II thường chứa 4 -6 nucleotid theo kiểu palindrome RE chỉ cắt ADN sợi đôi và tạo ra 2 đầu tận 5’-P và 3-OH. Đầu cắt có thể tà hoặc so le (đầu dính) Nếu trình tự nhận diện có phần nào tính đối xứng thì điểm cắt thường nằm giữa nó Polymerase – Đặc tính chung Hoạt tính tổng hợp 5’3’: gắn dNTP vào đầu 3’-OH của mồi và giải phóng PPi Hoạt tính exonuclease 3’5’: “sửa lỗi” Hoạt tính exonuclease 5’3’: hủy mồi Ribonuclease H: hủy ARN trong phức lai ARN-ADN Dịch chuyển sợi Khả năng xử lý Tần suất lỗiPolymerase – Đặc tính chung Phân loại ADN polymerase phụ thuộc ADN: enzym sao chép ARN polymerase phụ thuộc ADN: enzym phiên mã ADN polymerase phụthuộc ARN: reverse transcriptaseTaq polymerase o Hoạt động tối ưu ở 75-80oC, giảm 10 lần ở 37oC. Hoạt tính vẫn còn sau 2h ở 95oC o Ứng dụng: • Khuếch đại ADN bằng PCR • Giải trình tự ADN bằng pp dideoxy LigaseEnzym xúc tác phản ứng tạo liên kết phosphodiestergiữa 3’-OH và 5’-P của hai sợi acid nucleicChủng VSV và vector tạo dòng Chủng vi sinh vậtE. coli Bộ máy di truyền được nghiên cứu đầy đủ Tốc độ tăng trưởng nhanh Khả năng gây bệnh thấp Chủng vi sinh vậtJM103 o Nhân bản vector phage M13 o Dùng với plasmid pUC, plasmid sử dụng kỹ thuật bổ sung anpha để chọn lọc dòng tái tổ hợp o Mang gen cho đoạn omega của β-galactosidase trên plasmid F’, cho phép nó bị nhiễm bởi các phage dạng sợi như M13. Nếu mất plasmid F’ sẽ làm mất khả năng nàyDH5-ɑ o Mang đặc tính bổ sung anpha như JM103 o Đột biến gen recA làm mất khả năng tái tổ hợp tương đồng o Mang gen deoR đột biến giúp dễ thu nhận mảnh ADN lớn Vector tạo dòng Vật liệu di truyền trung gian chuyển và lưu trữ gen tái tổ hợp trong tb chủYêu cầu: o Có khả năng tự sao chép ở tb chủ o Có thể tồn tại ổn định trong tb chủ qua nhiều thế hệ o Trình tự nhận diện enzym cắt giới hạn đưa gen vào o Mang yếu tố chọn lọc để xác định tb có mang vector o Gồm • Plasmid • Vector phage tiêu giải từ phage lamda • Cosmid • Vector phage sợi M13 Vector plasmid Plasmid: ADN kép, vòng, nhân bản độc lập với NST Yêu cầu: o Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dòng tái tổ hợp, thường là một hay nhiều gen kháng kháng sinh o Có điểm Ori cho phép nhân bản độc lập NST. Plasmid được hiện nay có điểm Ori có thể kiểm soát được. VD: cho phép khuếch đại plasmid khi có mặt chất ức chế tổng hợp protein (như chloramphenicol)  hiệu suất cao khi chiết với độ tinh khiết khá tốt o Có vùng tạo dòng (MCS): là nhiều trình tự nhận diện duy nhất của các RE khác nhau nằm liên tiếp (polylinker), để cắt mở vòng plasmid và nối đoạn gen mong muốn vào.Plasmid được đưa vào tbchủ = biến nạp, thẩm điệnVD: pUC, pBR322, YT đánhpBluescript II dấu chèn Yếu tố chọn lọc Các vector plasmid pUC pBR322 pGEM và pBluescript ...