Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis - TS. Đinh Thị Thu Hằng

Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis do TS. Đinh Thị Thu Hằng biên soạn trình bày các nội dung chính sau: B. pseudomallei gây bệnh, hệ gen B. pseudomallei, kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP, thiết kế và đánh giá phản ứng TTSS1-real-time LAMP xác định vi khuẩn B. pseudomallei gây bệnh melioidosis. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediated isothermal amplification xác định nhanh vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis - TS. Đinh Thị Thu Hằng HỌC VIỆN QUÂN Y HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC 2020Thiết kế phản ứng TTSS1-real-time loop-mediatedisothermal amplification xác định nhanh vi khuẩnBurkholderia pseudomallei gây bệnh melioidosis TS. Đinh Thị Thu Hằng Hà Nội, T12 - 2020 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Burkholderia pseudomallei và melioidosis- Gram âm hoại sinh, gây bệnh melioidosis - viêm phổi, đa áp-xe, tử vong 40%.- Phân bố: bùn đất, nước các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.- A. Whitmore (1911)- Melioidosis: cấp và mạn tính - triệu chứng không đặc hiệu, dễ nhầm lẫn chẩn đoán, bỏ sót ca bệnh (“bệnh lao Việt Nam”). “Bom hẹn giờ Việt Nam” Wiersinga, W. J., et al. (2012). Melioidosis. N Engl J Med 367(11): 1035-44. Chen, Y. L., et al. (2014). PLoS Negl Trop Dis 8(5): e2877. 2Áp-xe do melioidosis White NJ (2003), Lancet, 361 (9370) , p1715–1722 3 Phân bố Melioidosis trên toàn cầu- Bắc Australia (viêm phổi ->tử vong phổ biến nhất (Currie B. J. 2015))- Đông Nam Á (Đông Bắc Thái Lan, bệnh nhiễm trùng tỷ lệ tử vong cao thứ 3, sau HIV/ AIDS và lao)- 1 số vùng châu Á, châu Mỹ, châu Phi (Limmathurotsakul D. et al. 2010, 2012).- NC mô phỏng:165.000 ca melioidosis ở người/ năm, 89.000 ca tử vong/ 80 quốc gia ( Limmathurotsakul D. et al. 2016), (Gohler A. et al. 2017) -> khó khăn trong xét nghiệm. Wiersinga, W. J., et al. (2012). Melioidosis. N Engl J Med 367(11): 1035-44. 4 Rotz, L. D., et al. (2002). Emerg Infect Dis 8(2): 225-230. B. pseudomallei gây bệnhĐộc lực: nội độc tố (phức hợp protein - lipopolysacharit)Đường lây:• Sol khí, tiếp xúc với đất ô nhiễm qua da trầy xước: thể phổi, ápxe phủ tạng, NKH. Điều kiện thuận lợi cho lây nhiễm: tiếp xúc nhiều với nước, bùn, động vật bị bệnh (ngựa, trâu, bò), suy giảm MD.• Trong đất, cánh đồng lúa, nước tù đọng, thường gặp mùa mưa lũ. 5 (Perumal Samy R. et al. 2017) Phòng và điều trị- Chưa có vắc xin, phòng không đặc hiệu- Điều trị: Phẫu thuật làm sạch vết thương + Phối hợp thuốc• Imipenem, doxycyclin, ceftazidim, …: 2 tháng tấn công, 3- 6T duy trì (thể nặng 12T).• Thể phổi >6T, phẫu thuật cắt bỏ thuỳ phổi -loại bỏ các ápxe phổi.• Dễ tái phát, thời gian, kinh phí=> Quân số, sức chiến đấu 6 B. pseudomallei và vũ khí sinh học• B. pseudomallei được liệt kê trong danh mục các tác nhân sinh học nhóm B, có tiềm năng sử dụng làm vũ khí sinh học (VKSH).• Hệ gen B. pseudomallei giống đến 99% so với B. mallei - được SD làm VKSH bởi quân đội Đức, Nhật, Nga• Quân đội Mỹ đã nghiên cứu B. pseudomallei để chế tạo VKSH. 7 Hệ gen B. pseudomallei Gene TTSS1 AF074878NST số 1: 3.460 CDS NST số 2: 2.395 CDSTrao đổi chất, tăng trưởng Thích ứng, tồn tại Holdenetal.(2004),10.1073/pnas.0403302101. 8 Các phương pháp xác địnhNuôi cấy: MT Ashdown - “tiêu chuẩn vàng”- 5-7 ngàyHuyết thanh học, miễn dịch: độ nhạy và độ đặc hiệu không caoPCR, real-time PCR: nguồn điện ổn định, PTN, nhân lực - chưa đáp ứng thực tế hiện trường 9 Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop mediated isothermal Amplification)- Khuếch đại DNA nhanh chóng - điều kiện đẳng nhiệt, sản phẩm là DNA mạch vòm 109-1010 lần, hiệu quả cao (Notomi T. et al. 2000 ).- Bst DNA polymerase & 4 mồi được thiết kế đặc biệt, sản phẩm có thể đánh giá bằng mắt thường về độ đục, màu sắc. 10 Ưu điểm của LAMP• Tiết kiệm• Độ nhạy, đặc hiệu cao• Dễ dàng thực hiện, thích hợp cho các loại tác nhân• Nhanh: khoảng 1-1,5 giờ• Thiết bị ổn nhiệt để duy trì nhiệt độ không đổi từ 60 - 65°C.• Không đòi hỏi DNA tinh sạch cao.=> Tiêu chí ASSURED test (affordable, sensitive, specific, user- friendly, rapid and robust, equipment-free and deliverable to end users) - thực địa.- real-time LAMP: kết hợp =>giúp rút ngắn thời gian, đơn giản hóa quá trình phát hiện B. pseudomallei 11 (Kaneko H. et al. 2007, (Njiru Z. K. 2012) Thế giới• Hơn 100 XN LAMP chẩn đoán mầm bệnh ở người và động vật: virus Dengue (Parida M. et al. 2005), vi khuẩn lao ( Geojith G. et al. 2011), S. aureus (Lim K. T. et al. 2013), KST sốt rét (Wu L. et al. 2015)... (Eiken Chemical Co. Ltd).• B. pseudomallei: Kỹ thuật LAMP gen đích TTSS1 và đánh giá ở Đông Bắc Thái Lan, ngưỡng: 38 copy/ phản ứng, mẫu lâm sàng Se 44%, Sp 98,4% (Chantratita N. et al. 2008).• Năm 2016: LAMP với hóa chất đông khô chưa được mô tả chi tiết (Michelle Wong Tzeling J. et al. 2016). 12 B. pseudomallei ở Việt Nam?• Đến 1973, có 343 ca melioidosis được ghi nhận trên lính Mỹ tham chiến tại Việt Nam (Schulin T. et al. 2001)+ một số chó nghiệp vụ. ~225.000 lính Mỹ có khả năng bị phơi nhiễm B. pseudomallei khi trở về nước (Perumal Samy R. et al. 2 ...