Bài giảng Tinh sạch protein (tt)

V. Phân tách protein bằng điện di trên gel Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di. V.1Điện di một chiều
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Tinh sạch protein (tt) Tinh sạch protein (tt)V. Phân tách protein bằng điệndi trên gelĐể đánh giá quá trình tinh sạchprotein có hiệu quả hay không, ngoàicách xác định hoạt tính đặc trưng củaprotein có tăng lên sau mỗi bước tinhsạch, còn một cách là làm hiện hìnhcác protein hiện diện trong mẫu saumỗi bước; điều này được thực hiệnnhờ kỹ thuật điện di. V.1Điện di một chiềuMột phân tử có mang điện tích sẽ dichuyển trong điện trường. Hiện tượngnày, được đặt tên là điện di, giúphướng tới một kỹ thuật rất mạnh đểphân tách protein và các đại phân tửkhác như DNA và RNA. Vận tốc dichuyển (v) của một protein (hay bấtkỳ phân tử nào) trong điện trường phụthuộc vào lực điện trường (E), điệntích thực của protein (z) và hệ số masát (f)Lực điện Ez kéo phân tử mang điệntích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởilực kéo của độ nhớt fv tăng lên do sựma sát giữa phân tử đang chuyểnđộng với môi trường. Lực ma sát phụthuộc vào cả khối lượng, hình dạngcủa phân tử đang di chuyển lẫn độnhớt (η) của môi trường. Với mộtkhối cầu có bán kính là r, ta cóĐiện di luôn được thực hiện trên gel(hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vìgel giống như một cái ray phân tử sẽlàm tăng sự phân tách. Những phân tửnhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể dichuyển xuyên qua gel, trong khi đónhững phân tử lớn hơn lỗ gel thì gầnnhư không di chuyển. Những phân tửcó kích thước trung bình di chuyểntrong gel với nhiều vận tốc khác nhau.điện di được thực hiện trên một bảngpolyacrylamide mỏng, thẳng đứng.Hướng của dòng điện từ trên xuống.Gel polyacrylamide, được tạo thànhtừ sự polymer hóa acrylamide và sựliên kết chéo củamethylenebisacrylamide, được chọnlàm môi trường cho điện di vì nó cótính trơ về mặt hóa học và được tạohình nhanh chóng. Điện di là mộtcách lọc qua gel mà theo đó tất cả cácphân tử, không xét về kích thước, sẽbị tác động một lực để di chuyểntrong cùng một chất nền. Gel ở đây cóthể xem tương đương với một hạttrong cột lọc gel.Các protein có thể được phân tách dựatrên khối lượng bằng điện di trênacrylamide dưới điều kiện đã bị biếntính. Hỗn hợp protein được hòa tantrong dung dịch sodium dodecylsulfate (SDS), một chất tẩy mang điệntích âm sẽ phá tất cả các nối khôngcộng hóa trị của protein ban đầu.Mercaptoethanol (2-thioethanol) haydithiothreitol cũng có thể được thêmvào để làm giảm số nối disulfide.Phức hợp SDS với protein đã bị biếntính có một điện tích thực âm tỉ lệthuận với khối lượng của protein.Điện tích âm có được do gắn với SDSlớn hơn rất nhiều điện tích của bảnthân protein ban đầu; vì thế, điện tíchban đầu của protein không ảnh hưởngđáng kể đến điện tích của phức hợp.Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ làmẫu để chạy điện di. Khi điện di kếtthúc, những protein trên gel sẽ đượcnhìn thấy là một dãy các băng bằngcách nhuộm với bạc hay một chấtnhuộm màu như Coomassie blue.Những đánh dấu phóng xạ có thểđược phát hiện bằng cách đặt một tấmphim chụp x quang lên miếng gel, quátrình này gọi là phóng xạ tự ghi.Những protein nhỏ di chuyển nhanhtrong gel, trong khi những protein lớnở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính diđộng của phần lớn các chuỗipolypeptide dưới những điều kiện nhưthế tỉ lệ với khối lượng của chúng.Tuy nhiên, cũng có vài protein giàucarbohydrate và protein màng khôngtuân theo mối tương quan này. SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kếtquả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ vớilượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol)protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộmvới Coomassie blue và thậm chí ít hơn(~0.02ug) vẫn có thể được phát hiệnkhi nhuộm bằng bạc. Những proteinchênh lệch về khối lượng khoảng 2%(ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhaukhoảng 10 acid amin) có thể phân biệtđược bằng SDS-PAGE.Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng tađánh giá kết quả của quá trình tinhsạch. Với những phân đoạn đầu tiên,kết quả là dãy gồm rất nhiều protein.Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, sốlượng protein sẽ giảm và sẽ có mộtbăng ngày càng đậm. Vạch đó tươngứng với protein mục tiêu. V.2 Điện di dựa vào điểm đẳng điệnCác protein còn có thể được phân táchbằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acidamin có tính acid và số acid amin cótính base của chúng. Điểm đẳng điệncủa một protein (pI) là điểm pH mà ởđó điện tích thực của nó bằng 0. Tạiđiểm pH này, tính di động của proteintrong điện trường cũng bằng 0 bởi vìz trong công thức (1) bằng 0. Mỗi mộtprotein có một pI riêng; ví dụ như pIcủa cytochrome C, một protein vậnchuyển ion có tính base cao, là 10.6,trong khi pI của albumin huyết thanh,một protein có tính acid trong máu, là4.8. Giả định cho một hỗn hợp proteinchạy trong điện trường trong mộtmiếng gel với một khuynh độ pH,không có sự hiện diện của SDS. Mỗiprotein sẽ di chuyển cho đến khi nóđến vị trí mà tại đó pH bằng pI củanó. Dựa vào hiện tượng này, ta cóphương pháp phân tách protein dựavào điểm đẳng điện của protein. đểtạo Khuynh độ pH, trước hết là chovào gel một hỗn hợp polyampholyte(những polymer nhỏ đa điện tích) cón ...