Bài giảng Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới - Bs. Phạm Hùng Vân

Bài giảng Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới do Bs. Phạm Hùng Vân biên soạn trình bày các nội dung chính sau: Thách thức trong cấy đàm; Lấy đúng bệnh phẩm đàm; Phát hiện tác nhân bằng kỹ thuật miễn dịch;... Mời các bạn cùng tham khảo để nắm nội dung chi tiết.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bài giảng Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới - Bs. Phạm Hùng Vân Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới Phạm Hùng Vân* *Chủ Tịch Hội Vi Sinh Lâm Sàng TP. HCM Chủ Tịch Chi Hội SHPT Y Khoa Việt Nam Trưởng Đơn Vị Vi Sinh – SHPT Lâm Sàng BV. NTP Quệt MŨI SAU Phát hiện virus QUYỆT HỌNG Không ý nghĩa CẤY ĐÀM hay DNT BỆNH PHẨM CÓ ĐÀM Màng não CẤY MÁU Máu DỊCH Màng phổi MÀNG PHỔI Thách thức trong cấy đàm  Phải bắt được vi khuẩn gây bệnh từ mẫu tạp nhiễm, do vậy phải lấy đúng bệnh phẩm đàm và phải đánh giá để chọn đúng vi khuẩn gây bệnh mọc trên mặt thạch phân lập  Có nhiều loại là vi khuẩn gây bệnh là khó mọc, do vậy phải cấy ngay và có đủ các loại môi trường cần thiết Lấy đúng bệnh phẩm đàm  Phải hướng dẫn bệnh nhân lấy đàm,  Phải có phương tiện và phương pháp lấy đàm khi bệnh nhân không thể khạc đàm  Phải lấy đàm ngay khi chẩn đoán và trước khi dùng kháng sinh  Phải đánh giá đại thể mẫu đàm rước khi gửi mẫu đi đến phòng xét nghiệm. ? ? ? ? Chọn đúng vi khuẩn gây bệnh Nguyên tắc chọn VK gây bệnh  Ưu tiên 1: Chọn vi khuẩn phù hợp với hình ảnh vi khuẩn thấy trong vùng bạch cầu của phết nhuộm Gram mẫu đàm  Ưu tiên 2: Chọn vi khuẩn ưu thế (định lượng hay bán định lượng Lưu ý: Vi khuẩn có số lượng nhiều nhưng cũng có thể không phải là vi khuẩn gây bệnh mà chỉ là VK quần cư, vi khuẩn thường trú hầu họng (Streptococci tiêu huyết α) Song cầu Gram [+] giống Song cầu Gram [-] giống S. pneumoniae M. catarrhalis Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống H. influenzae H. influenzae LÝ DO NUÔI CẤY THẤT BẠI  S. pneumoniae, H. influenzae là chủ yếu nhưng không dễ nuôi cấy, đòi hỏi các môi trường phân lập ít có sẵn  Bệnh phẩm ít được cấy ngay  Bệnh nhân dùng kháng sinh trước  Mẫu không tin cậy do lẫn nước bọt (tạp khuẩn hầu họng)  Không biết cách đánh giá kết quả nuôi cấy để chọn đúng VK gây bệnh Cấy máu Thách thức trong cấy máu  Cấy máu là phương tiện tốt nhất xác định tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi (CAP), tuy nhiên không phải tất cả mọi trường hợp CAP đều cấy máu [+] (Tối đa chỉ 14-16%)  Coi chừng ngoại nhiễm trong cấy máu. Kết quả [+] trong 24 giờ, hay cả 2 chai cấy cùng [+] một loại VK thường ít khi là ngoại nhiễm.  Kết quả cấy máu phải kịp thời, muống vậy phải dùng phương tiện thích hợp và phải có qui trình trả kết quả nhanh Phát hiện tác nhân bằng kỹ thuật miễn dịch  Phát hiện kháng nguyên hòa tan VK gây bệnh (S. pneumoniae, L. pneumophila) trong nước tiểu. Độ nhạy thấp  Phát hiện kháng nguyên trong mẫu đàm, quyệt mũi sau bằng ELISA, MDHQ: Phát hiện tác nhân virus, VKKĐH. Độ nhạy thấp  Huyết thanh học tìm kháng thể đặc hiệu phát hiện tác nhân virus, VKKĐH: Nếu là IgG thì phải huyết thanh kép cách 10 ngày; nếu là IgM thì phải có giá trị cắt và tùy thuộc chất lượng kit Phát hiện tác nhân vi sinh gây ARI GIẢI PHÁP NÀO PHÙ HỢP?  VI SINH TRUYỀN THỐNG (nuôi cấy) Không nhạy, không đầy đủ  HUYẾT THANH (kháng thể đặc hiệu) Không hữu dụng (IgG), kém đặc hiệu (IgM)  HOÁ MIỄN DỊCH (kháng nguyên đặc hiệu) Độ nhạy kém  REAL-TIME PCR (trình tự NA đặc hiệu) Độ nhạy cao, đặc hiệu cao Nguyên tắc PCR cơ sở của độ nhạy tuyệt vời ADN đích 4 1 Biến tính (94o C) 1 2 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 3 Kéo dài (72o C) Taq polymerase n PCR là nuôi cấy đoạn gen cơ sở của độ đặc hiệu không khác nuôi cấy Nuoâi caáy PCR Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa hoïc Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn gen bieåu hieän töø caùc kieåu gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa ñoaïn gen Real-time PCR Chạy PCR đồng thời phát hiện kết quả Ct curve Standard curve Melt curve “Streamline” Real-time PCR CÁC BỆNH PHẨM KHÁC NHAU (Máu, mô, đàm, mủ, dịch cơ thể) TÁCH CHIẾT DNA/RNA NKDNARNAprep-MAGBEAD Một bộ thuốc thử cho DNA và RNA Chỉ 5 bước thực hiện Độ nhạy gấp 100 lần thủ công Tương thích cho KingFisher Các thiết bị KingFish ...