BÁO CÁO KHOA HỌC: BIỂU HIỆN GEN LACZ MÃ HOÁ BETAGALACTOSIDAZA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI ATCC 11105 TRONG E. COLI BL21

Xúc tác quá trình thuỷ phân galactosyl ở vị trí tận cùng của hydratcacbon, glycoprotein và galactolipit [1].
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "BIỂU HIỆN GEN LACZ MÃ HOÁ BETAGALACTOSIDAZA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI ATCC 11105 TRONG E. COLI BL21"BIỂU HIỆN GEN LACZ MÃ HOÁ BETA-GALACTOSIDAZA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIACOLI ATCC 11105 TRONG E. COLI BL21Trần Minh Trí, Nguyễn Thị Thanh Lịch, Trương NamHải.Viện công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG.Ngô Tiến HiểnViện Công nghiệp thực phẩm.ĐẶT VẤN ĐỀ-Galactosidaza (-D-galactosidase galactohydrolase,EC3.2.1.32) xúc tác quá trình thuỷ phân galactosyl ở vị trítận cùng của hydratcacbon, glycoprotein và galactolipit [1].-Galactosidaza thuỷ phân cơ chất từ đầu không khử, tại vịtrí -D-galactosyl tận cùng của -D-galactosizit [2, 3] đểchuyển hóa lactoza thành galactoza và glucoza [3, 4]. -Galactosidaza có mặt phổ biến trong giới động vật, thựcvật, nấm và vi sinh vật. Ở vi khuẩn, cấu trúc và khối lượngphân tử của -galactosidaza rất khác nhau. Enzym này cóthể tồn tại dưới dạng một tiểu phần như -galactosidaza củaThermus sp.A4 (khối lượng phân tử 75 kDa), và dạng nhiềutiểu phần như -galactosidaza của T. aquaticus (khối lượngphân tử lớn hơn 700 kDa). -galactosidaza của E. coli tồntại dưới dạng một protein gồm 4 tiểu phần giống nhau,chức năng hoạt động của mỗi tiểu phần độc lập với nhau vàcó khối lượng phân tử là 116,353 kDa [2].-Galactosidaza được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngànhcông nghiệp. Trong công nghiệp thực phẩm, -galactosidaza được bổ sung vào quá trình lên men từ bơ sữanhư kem, sữa chua để tránh sự kết tinh lactoza. Trong quytrình sản xuất sữa, -galactosidaza được bổ sung để thuỷphân lactoza, làm tăng độ ngọt của sữa [1, 4]. Trong ngànhy học, -galactosidaza được điều chế làm thuốc trợ tiêu hoá[4]. Trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp, -galactosidaza đóngvai trò dấu chuẩn trong quá trình tách và chọn dòng phân tửnhờ hiện tượng bất hoạt enzym trên các vectơ có chèn gentái tổ hợp.Trong bài báo này, chúng tôi sẽ trình bày các phương phápđã tiến hành để tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năngtổng hợp -galactosidaza cao. Gen lacZ từ chủng E. coliATCC 11105 được nhân lên bằng kỹ thuật PCR và đưa vàovectơ biểu hiện pET-22b(+) để tạo vectơ pET-22bLacZ.Sau đó vectơ này được biến nạp vào chủng biểu hiện E.coli BL21 để tổng hợp -galactosidaza.I. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPI.1. Nguyên liệu- Plasmit pET-22b(+) (5493bp) do hãng Novagen cung cấpđược sử dụng làm vectơ biểu hiện gen LacZ. Cặp mồi dùngnhân gen LacZ do hãng GENSET Singapore Biotech.PteLtd tổng hợp. Enzym hạn chế sử dụng của hãng Bio-Lab.Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu của hãng Sigma (Mỹ),Prolabo (Pháp), BDH (Đức), Meck (Đức), Fluka (Đức).- Các thiết bị máy móc cần thiết cho nghiên cứu chuyểngen của các hãng Perkin Elmer (Mỹ), Eppendorf (Đức),Binder (Đức), Infors (Thuỵ Sỹ), Toledo (Thuỵ Sỹ),Phamacia (Thuỵ Điển), Bio Rad (Mỹ), Sovall (Mỹ), MJ –Research (Mỹ).I.2. Chủng vi khuẩn- Chủng vi khuẩn E. coli ATCC11105 là chủng cung cấpnguồn gen LacZ mã hoá cho -galactosidaza.- Chủng vi khuẩn E. coli BL 21[E omp hsd SB(rBmB)galdcm (DE3) plysS(Caml)] được sử dụng làm vật chủ chobiểu hiện dòng gen.I.3. Nhân gen LacZ mã hoá -galactosidaza bằng kỹthuật PCRDựa vào trình tự gen LacZ của E. coli trong ngân hàng genquốc tế (gi:7428187), cặp mồi LacZF1-Nco I và LacZR2-Xho I được thiết để dùng cho PCR (hãng GENSETSingapore Biotech.Pte Ltd tổng hợp). PCR được tiến hànhnhư sau: Biến tính ADN ở 940C trong 3 phút; nhân ADNbằng 25 chu trình nhiệt với các bước sau: 940C trong 1phút, 550C 1 phút, 720C trong 1 phút 30 giây. Phản ứngnhân ADN kết thúc ở 720C trong 8 phút. ADN được giữ ở40C sau khi kết thúc PCR.I.4. Đưa gen LacZ vào vectơ pET-22b(+)Để đưa gen LacZ vào vectơ pET-22b(+) tại vị trí Nco I vàXho I trong vùng đa nối, sản phẩm PCR và vectơ pET-22b(+) được xử lý bằng hai enzym hạn chế Nco I và Xho I.Đoạn gen LacZ và plasmit sau khi xử lý có kích thướctương ứng ~ 3 kb và ~ 5,4 kb, được nối lại với nhau bằngADN ligaza. Sản phẩm phản ứng nối ghép được biến nạpvào tế bào E. coli BL 21.I.5. Điều kiện môi trường cảm ứngCấy chuyển từ khuẩn lạc đơn, dòng tế bào E. coli BL 21mang vectơ biểu hiện pET-22bLacZ sang 5 ml môi trườnglỏng LB + Amp, nuôi lắc 370C qua đêm đến pha ổn định.Từ dịch nuôi cấy qua đêm cấy chuyển 1ml sang bình 500ml chứa 100 ml LB lỏng + Amp, nuôi lắc 370C, sau 2 giờ(OD600nm = 0.6), môi trường được bổ sung chất cảm ứngIPTG (nồng độ cuối cùng 1mM) và tiếp tục nuôi lắc 200v/phút ở nhiệt độ 200C. Tế bào được thu sau 12 giờ cảmứng.I.6. Tinh sạch -galactosidazaChuẩn bị cột 1.5x15 cm. Chuyển 4 ml dịch Talon Resin lêncột. Cân bằng cột bằng đệm: 50 mM sodium phosphat; 300mM NaCl, pH 7,4. Tinh chế mẫu qua cột ái lực: ly tâm thutế bào sau cảm ứng ở điều kiện 5000 v/phút trong 10 phút ở40C. Hoà tế bào E. coli trong 10 ml đệm Tris 10 mM pH 8;0,2 phenylmethylsulphonyl fluoride. Tế bào được phá bằnglyzozyme khi ủ ở 300C, 60 phút. Dịch sau khi phá được litâm ở 13.000 v/phút trong ...