BÁO CÁO KHOA HỌC: HÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ NƯỚC THẢI VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE CỦA 102 CHỦNG PSEUDOMONAS

Lipase là enzym xúc tác thủy phân triglycerid thành diglycerid, monoglycerid hoặc glycerol và các axit béo nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu nước. Lipase vi khuẩn có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, hóa học, mỹ phẩm, thuộc da, trong y dược và xử lý môi trường [1].
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "HÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ NƯỚC THẢI VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE CỦA 102 CHỦNG PSEUDOMONAS"HÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢPLIPASE TỪ NƯỚC THẢI VÀ KHẢO SÁT HOẠTTÍNH LIPASE CỦA 102 CHỦNG PSEUDOMONASQuyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy, Mai Thị Thanh,Nguyễn Thị Thảo, Lê thị Thu Giang,Nguyễn Thị TuyếtNhung, Nguyễn Ngọc DũngViện Công nghệ Sinh họcMỞ ĐẦULipase là enzym xúc tác thủy phân triglycerid thànhdiglycerid, monoglycerid hoặc glycerol và các axit béo nhờhoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu nước. Lipase vikhuẩn có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm,hóa học, mỹ phẩm, thuộc da, trong y dược và xử lý môitrường [1]. Hàng năm doanh thu lipase đạt hàng trăm triệudollar Mỹ trên thị trường enzym công nghiệp [2]. Để sảnxuất lipase công nghiệp, người ta áp dụng kỹ thuật tái tổhợp nhằm tạo chủng vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh,năng suất tổng hợp lipase cao, hoạt tính đặc hiệu cho từngcơ chất và ổn định trong một thời gian dài dưới các điềukiện kiềm, nhiệt độ cao [3, 4].Việt Nam đang hiện đại hóa và công nghiệp hóa đất nước,ngành công nghiệp thực phẩm, giặt tẩy, hóa chất cần rấtnhiều enzym đặc biệt là lipase, song các chế phẩm lipaseđang sử dụng chủ yếu là nhập khẩu. Do đó việc nghiên cứuvà triển khai sản xuất lipase trong nước đang được quantâm [5]. Hơn nữa việc nghiên cứu và sản xuất công nghiệplipase trong nước phải mang lại hiệu quả kinh tế, an toàn vàkhông gây ô nhiễm môi trường. Do nhu cầu về lipase ởtrong nước cao, chúng tôi đã phân lập, nuôi cấy và xác địnhhoạt tính lipase một số chủng vi sinh vật từ môi trường.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Nguyên liệuMẫu nước thải. Mẫu nước thải được thu thập từ cống rãnhcác nơi khác nhau như Xí nghiệp Da Mai động, Xí nghiệpThủy sản Thanh xuân, hồ Hoàn Kiếm, lò mổ Khươngthượng, và sông Tô lịch.Hóa chất. Các hóa chất dùng để làm môi trường nuôi cấyđều mua từ các hãng hóa chất nổi tiếng: Bacto-peptone,Yeast extract (Difco); Gum arabic (Sigma); agar (Merck).Các loại dầu dùng làm cơ chất thuộc dầu tinh luyện, chấtlượng cao.Môi trường. Môi trường nuôi cấy bao gồm NaCl (1,0%),peptone (1,0%), cao nấm men (0,5%), dầu thực vật (1,0%),đối với môi trường rắn bổ sung 2% agar.2. Phương phápPhân lập. 1 ml nước thải và cặn bã được khuấy trộn đều vàly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được phaloãng 1:102-104 lần với nước cất khử trùng và 100 l dịchpha loãng được trang trên đĩa thạch bán kính 11 cm. Sau đóủ đĩa thạch trong tủ ủ nhiệt độ 28oC và sau 24-48 giờ mangđĩa thạch để đánh giá các khuẩn lạc thu được. Trên đĩathạch xuất hiện khuẩn lạc nào có vòng sáng xung quanh thìkhuẩn lạc đó có khả năng sinh tổng hợp lipase. Các khuẩnlạc sinh tổng hợp lipase được nuôi cấy trong 3 ml môitrường, nhiệt độ 28oC trong 24 giờ. Sau đó pha loãng1:108-1010, lấy 100 l dịch pha loãng trang trên đĩa thạchđể chọn ra các khuẩn lạc thuần khiết không pha tạp. Tiếptục làm cho tới khi trên đĩa thạch chỉ xuất hiện duy nhấtmột loại khuẩn lạc. Cuối cùng khuẩn lạc này được nuôi cấytrong 3 ml qua đêm ở nhiệt độ 28oC, và bảo quản vớiglycerin 75% ở nhiệt độ -80oC.Nuôi cấy. Các khuẩn lạc có vòng sáng lớn trên đĩa thạchchứa 0,5% tributyrin được cấy vào 3 ml môi trường LB vànuôi lắc 220 vòng/phút qua đêm ở nhiệt độ 30oC. Dịch nuôicấy cấp I được cho vào 50 ml môi trường LB theo tỷ lệ 100l/100 ml môi trường và được tiếp tục nuôi lắc 220vòng/phút, nhiệt độ 30oC. Sau 24, 48, 72, 96, 120 và 144giờ các mẫu dịch nuôi cấy được lấy ra để đo OD600 và hoạttính lipase.Xác định hoạt tính lipase. Hoạt tính lipase được xác địnhbằng phương pháp chuẩn độ tự động pH-Stat trên máy 718Stat Titrino [5-6].KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1. Phân lậpĐể phân lập các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lipase,chúng tôi đã lấy mẫu đất và nước thải xung quanh các xínghiệp thuộc da Mai Động, xí nghiệp chế biến hải sảnNhân Chính, lò mổ Khương Thượng, sông Tô Lịch và hồHoàn Kiếm. Từ các mẫu nước thải đó đã phân lập được 41chủng sinh tổng hợp lipase (hình 1) trong đó có 8 chủngkháng streptomycine. Các chủng phân lập được nuôi cấytrong 3 ml môi trường và bảo quản ở -80oC (bảng 1). Hình 1. Định tính lipase trên đĩa thạch agar chứa 0,5%tributyrin. A) Các chủng vi sinh vật M1 (1), M2 (2), M3(3), M4 (4),B1 (5), B2 (6). B) Các chủng Pseudomonas:ĐN1 (1), ĐN2 (2), ĐN3 (3), ĐN4 (4), ĐN6 (5), KT4 (6).Bảng 1. Các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp lipase đượcphân lập từ nước thải. Nơi lấy mẫu: B: bơ; CR cống rãnh,LM: lò mổ; MD: Mai động; M: mỡ; HK: Hoàn kiếm. HT:Hoạt tính lipase được đánh giá theo vòng sáng thủy phân dầu Marvella. Vàng C: vàng cam; vàng N: vàng nghệ.2. Nuôi cấy 5 chủng có hoạt tính caoTrong số đó, 5 chủng B1, LM27, M1, M42 và CRS3(kháng lại streptomycine) đã được nuôi cấy trong 50 mlmôi trường trong 7 ngày để đo tốc độ phát triển và xác địnhhoạt tính lipase. Các chủng đều phát triển tốt và đạt nồngđộ OD600nm tối ưu sau 72 giờ nuôi cấy, t ...