BÁO CÁO KHOA HỌC: NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH AMYLAZA CỦA HAI CHỦNG Bacillus sp H5-1 VÀ H5-4 DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ

Trong nhiều loại nguyên liệu để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh có chứa tinh bột (bột sắn, thân rễ cây, củ vv..), do vậy trong bộ vi sinh vật dùng trong sản xuất loại phân bón này, ngoài các vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloz, cố định nitơ, phân giải protein, chuyển hoá các hợp chất photpho khó tan thành dễ tan, sinh chất kích thích sinh trưởng và chất kháng sinh, người ta còn bổ sung các vi sinh vật phân giải tinh bột....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH AMYLAZA CỦA HAI CHỦNG Bacillus sp H5-1 VÀ H5-4 DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ"NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH AMYLAZA CỦA HAICHỦNG Bacillus sp H5-1 VÀ H5-4 DÙNG TRONGSẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠNguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị KimQuyTrung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà NộiI. MỞ ĐẦU Trong nhiều loại nguyên liệu để sản xuất phân bón hữucơ vi sinh có chứa tinh bột (bột sắn, thân rễ cây, củ vv..), dovậy trong bộ vi sinh vật dùng trong sản xuất loại phân bónnày, ngoài các vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloz,cố định nitơ, phân giải protein, chuyển hoá các hợp chấtphotpho khó tan thành dễ tan, sinh chất kích thích sinhtrưởng và chất kháng sinh, người ta còn bổ sung các vi sinhvật phân giải tinh bột. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọncác chủng vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải tinh bộtđể bổ sung cho bộ vi sinh vật tạo chế phẩm dùng trong sảnxuất phân bón hữu cơ.II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨUa. Vi sinh vật.Các chủng vi sinh vật được phân lập từ đất các tỉnh miềnBắc Việt Nam. Các chủng được giữ và bảo quản tại Bảotàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ Sinhhọc - Đại học Quốc gia Hà Nội.b. Môi trường MT2 dùng trong nghiên cứu (g/l): Tinh bộttan-10, CaCl2- 0,2, MgSO4-0,2; NaHCO3-0,2; K2HPO4-5,0;NaCl-0,2. Khử trùng 121oC trong 15 phút. pH = 6,8c. Xác định hoạt tính amylaza theo phương pháp củaSrivastava [5].d. Xác định amylaza bằng sắc ký bản mỏng theo phươngpháp của Badal saha [2].e. Xác định amylaza bằng điện di trên gel polyacrylamit[3].III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Kết quả nhận biết amylaza bằng sắc ký bản mỏngChúng tôi tiến hành xác định hoạt tinh amylaza của 2chủng bằng phương pháp sắc ký bản mỏng. Hình 1. Kết quả sắc ký bản mỏng của 2 chủng Bacillus i H5-1 và H5-4.Chú thích: Chấm 1: -amylaza chuẩnChấm 2: Bacillus sp H5-1Chấm 4: Bacillus i H5-4 Kết quả cho thấy cả 2 chủng đều sản sinh glucoza vàmantoza nhưng chủ yếu là glucoza. Điều đó chứng tỏ hoạttính amylaza của hai chủng bao gồm cả  - amylaza,  -amylaza và glucoamylaza.3. 2. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đối với sinh tổnghợp amylazaAmylaza thuộc nhóm enzym cảm ứng với các nguồn dinhdưỡng là glucoxit. Bởi vậy việc sinh tổng hợp enzym phụthuộc đáng kể vào sự có mặt và nồng độ của các chất cảmứng này. Theo nhiều nhà nghiên cứu thì chất cảm ứng thíchhợp cho sinh tổng hợp amylaza của vi khuẩn Bacillus làmaltoza hoặc sản phẩm thuỷ phân của tinh bột [4]. Một sốkhác lại cho rằng chất cảm ứng là isomaltoza và penoza.Đó là những loại đường chứa mối nối -1,6 mà -amylazakhông có khả năng phá huỷ [2].Để khảo sát ảnh hưởng của các nguồn gluxit chúng tôi đãsử dụng cơ chất với tỷ lệ 3% vì nếu thấp hơn sẽ không đủnhu cầu cung cấp năng lượng cho vi khuẩn, còn nếu trên3% thì những mẫu có tinh bột sẽ rất đặc, ảnh hưởng tới quátrình thông khí.Kết quả được trình bày ở hình 2Hình 2. Ảnh hưởng của các nguồn cabon đến sinh tổng hợp amylaza ở hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4.Kết quả thử nghiệm cho thấy cả 2 chủng đều có khả năngđồng hóa các nguồn cơ chất khác nhau: bột gạo, bột mì,cám gạo, dextrin, bột ngô. Lượng đường khử sinh ra là caonhất khi cho enzym tác dụng lên cơ chất là bột ngô. Phảichăng ở đây ngoài việc thoả mãn nhu cầu về năng lượngcho vi khuẩn còn có vai trò của sinh tổng hợp cảm ứngamylaza mà vai trò này liên quan mật thiết bởi vì có một sốtác giả cho rằng tinh bột có trọng lượng phân tử lớn khôngthể lọt qua màng tế bào để enzym có thể tác dụng trực tiếptới bộ máy điều hoà sinh tổng hợp cảm ứng enzym được[1]. Vậy ngoài nhu cầu về năng lượng, cơ chất đóng vai tròquan trọng trong quá trình sinh trưởng và sinh amylaza củavi khuẩn.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ lên hoạt tính amylazacủa 2 chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4.Hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4 được nuôi trong môitrường MT2 trên máy lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 50oC, tốc độ220 vòng/phút. Sau 56 giờ ly tâm thu dịch enzym thô.Eznym có bổ sung CaCl2 với các nồng độ 2; 4mM và đượcxử lý ở nước sôi 100oC trong 15 và 30 phút. Kết quả đượctrình bày ở bảng 2.Bảng 2. Ảnh hưởng của Ca2+ lên độ bền nhiệt của amylaza cuả 2 chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4Kết quả thực nghiệm cho thấy độ bền nhiệt của amylazatăng lên khi bổ sung Ca2+ vào dịch enzym thô. Khi khôngcó Ca2+ hoạt tính amylaza giảm đi rất nhanh, hoạt tính bịmất nhanh sau 15, 30 phút xử lý nhiệt. Nhiều nghiên cứucho rằng khi tách Ca2+ ra khỏi enzym 2 nhóm –SH lộ rangoài và do đó làm mất hoạt tính phân huỷ amylaza củaenzym [5]. Khi Ca2+ liên kết với apo- - amylaza, toàn bộhoạt tính của enzym được thể hiện và 2 nhóm –SH đượcnối với nhau. Kết quả này phù hợp với nhận định củaMachius cho rằng Ca2+ làm ổn định hoá cấu trúc bậc III củaenzym amylaza khi ở nhiệt độ cao [3]. Nồng độ Ca2+ thíchhợp là 2mM trong thời gian xử lý nhiệt là 15 phút.3.5. Kiểm tra amylaza bằng điện di trên gelpolyacrylamit Để kiểm tra enzym, cần xác định băng hoạt tính của  -amylaza. Do vậy trong dung dịch không biến tính với SDS,tuy nhiên trong gel 7,5% chạy vẫn cho SDS. Điện di chạy ở1mA ở 4oC trong 3 giờ. Lượng enzym được đưa vào vớithể tích 20l. Sau khi kết thúc điện di, gel được tẩy SDSbằng Triton - X nồng độ 2,5% trong 30 phút. Sau đó, ủtrong đệm axetat có pH = 6,8 ở 50oC trong 1 giờ. Cuốicùng gel được nhuộm với dung dịch Lugol (0.15% I2, 1,5%KI) trong 20 phút để xác định băng hoạt tính amylaza.Kết quả được thể hiện ở hình 3. Hình 3. Điện di đồ enzym trên gel polyacrylamit của hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4 Băng 1 : Biểu hiện hoạt tính amylaza của chủng Bacillus sp H5-1. Băng 2 :  - amylaza chuẩn Băng 3 : Biểu hiện hoạt tính amylaza của chủng Bacillus sp H5-4 Kết quả cho thấy cả hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4 đều biểu hiện bă ...