BÁO CÁO KHOA HỌC: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPDPCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE

Từ lâu, nấm linh chi (Ganoderma) được biết tới như một loại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ và chữa trị nhiều loại bệnh (bệnh thận, gan, bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch, dị ứng...). Ganoderma có khả năng tăng cường sự thải độc ở gan và kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động hiệu quả hơn.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPDPCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE"NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHIGanoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPD-PCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASENguyễn Hoài GiangViện Vệ sinh Dịch tễ Trung ươngNguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lê Đình LươngTrung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nộiĐẶT VẤN ĐỀTừ lâu, nấm linh chi (Ganoderma) được biết tới như mộtloại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ vàchữa trị nhiều loại bệnh (bệnh thận, gan, bệnh tiểu đường,bệnh tim mạch, dị ứng...). Ganoderma có khả năng tăngcường sự thải độc ở gan và kích thích hệ thống miễn dịchhoạt động hiệu quả hơn. Ganoderma còn kìm hãm sự sinhtổng hợp ADN mới của tế bào ung thư, kìm hãm sự pháttriển của các khối u và hạn chế sự di căn. Các nghiên cứu yvà dược học cũng cho thấy các loài Ganoderma khác nhaucũng có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có hoạttính khác nhau (1). Việc phân loại Ganoderma dựa vàohình thái và các isozym gặp nhiều khó khăn, nhiều khithiếu chính xác. Gần đây, việc sử dụng đoạn trình tự ITS(Internal Transcribed Spacer) của ADN ribosom và kỹthuật nhân bản ngẫu nhiên ADN bằng mồi tuỳ ý (RandomAmplified Polymorphic DNA: RAPD) đã góp phần quantrong trọng việc phân loại Ganoderma ở mức độ ADN (2).Ngoài tác dụng làm thuốc, Ganoderma cũng là những loàinấm gây bệnh và phá huỷ nhiều cây thân gỗ. Laccase,lignin peroxidases (LIPs) và peroxidases phụ thuộc mangan(MNPs) là ba nhóm enzym được cho là có vai trò quantrọng trong việc phân huỷ gỗ của các loại nấm. Enzymlaccase, LIPs và MNPs có khả năng oxy hoá các phứcphenolic để tạo thành gốc phenoxy. Mỗi phân tử enzymlaccase liên kết với bốn nguyên tử đồng. Những nghiên cứuvề cấu trúc và chức năng của laccase cho thấy tại vị trí giữamột axit amin cystein và mười axit amin histidin là điểmbám cho bốn nguyên tử đồng và trình tự ở quanh vị trí nàythường rất ít thay đổi ở những loài nấm khác nhau (3, 4).Nghiên cứu này giới thiệu một cách tiếp cận nhằm gópphần phân loại và xếp nhóm ở Ganoderma: Sử dụngRAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên OPU1 và PCR với cặpmồi đặc hiệu cho hai đoạn trong gen laccase.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:Vật liệu:Các mẫu nấm Ganoderma lucidum với các nhóm dưới loàikhác nhau được ký hiệu là Gl 1 và Gl 2; Ganodermaaustrale sensulato với các nhóm dưới loài khác nhau đượcký hiệu là Ga 1 và Ga 2; Ganoderma applanatum sensulatovới các nhóm dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gb 1 vàGb 2; Ganoderma tortnatum sensulato với các nhóm dướiloài khác nhau được ký hiệu là Gc 1 và Gc 2; Ganodermaaustrale được ký hiệu là Gau, do phòng thí nghiệm nấm -Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nộicung cấp.Phương pháp nghiên cứu:- Tách chiết ADN từ các mẫu Ganoderma theo phươngpháp của Porebski và được thích ứng với điều kiện phòngthí nghiệm của Việt Nam theo cải tiến của các tác giảNguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình Lương (6).- Kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1, trình tự là 5-ACGGACGTCA -3 (6). - PCR với mồi đặc hiệu cho 2đoạn gen laccase của G. lucidum 103561 (4).- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid 6% vànhuộm bạc (7).KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNSử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để phân loại GanodermaĐoạn trình tự ITS của ADN ở ribosom được sử dụng rấtphổ biến trong nghiên cứu phân loại Ganoderma. Tuynhiên, thông tin về trình tự vùng ITS nhiều khi không thayđổi ở một số taxon gần nhau. Do vậy nếu chỉ sử dụng kếtquả đoạn ITS sẽ không đảm bảo có sự chính xác cao trongphân loại Ganoderma (2). Trong thời gian gần đây, kỹthuật RAPD-PCR được sử dụng rất phổ biến và là mộttrong những phương pháp nhạy, có hiệu quả cao để phânbiệt những taxon không thể phân biệt được bằng ITS (2).Để phân loại các loài Ganoderma mà chúng tôi hiện đangcó, kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1 được sử dụng (6).Điều kiện PCR sau khi được tối ưu hoá là 94oC 2 phút/ 35chu kỳ với 94oC 1 phút, 46oC 30 giây, 72oC 2 phút/ 72oC10 phút.Kết quả điện di trên gel polyacrylamid 6% và nhuộm bạccho thấy: các mẫu Ganoderma lucidum có 5 băng ADNgiống nhau với kích thước khoảng 1636, 800, 690, 630 và450 bp; các mẫu Ganoderma australe sensulato có 4 băngADN giống nhau với kích thước khoảng 1824, 407, 370 và300 bp; các mẫu Ganoderma applanatum sensulato có 3băng ADN giống nhau với kích thước khoảng 310, 240 và140 bp; các mẫu Ganoderma tortnatum sensulato có 4 băngADN giống nhau với kích thước khoảng 702, 510, 412 và350 bp. Mẫu Ganoderma australe có 1 băng ADN kíchthước khoảng 450 bp giống như các mẫu Ganodermalucidum.Kết quả RAPD-PCR với mồi OPU 1 cho thấy các mẫu nấmGanoderma lucidum, Ganoderma australe sensulato,Ganoderma applanatum sensulato, Ganoderma tortnatumsensulato và Ganoderma australe có những băng ADN đặctrưng riêng của từng loài. Hơn nữa, ở các mẫu dưới loàingoài những băng khác nhau, giữa chúng còn có nhữngbăng đặc trưng riêng biệt. Hình 1. Kỹ thuật RAPD-PCR với các mẫu Ganoderma ...