BÁO CÁO KHOA HỌC: NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU THẬP TỪ MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN (TỈNH ĐỒNG NAI)

Lâm trường Mã Đà thuộc tỉnh Đồng Nai là một trong những khu vực chịu nhiều tác động của các yếu tố môi trường khắc nghiệt, đặc biệt là các tác động của chiến tranh hoá học. Tuy vậy, cho đến nay vẫn còn rất ít công trình nghiên cứu về các tác động này lên các sinh vật có mặt ở đây.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU THẬP TỪ MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN (TỈNH ĐỒNG NAI)"NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘTSỐ LOÀI THỰC VẬT THU THẬP TỪ MÃ ĐÀ VÀCÁT TIÊN (TỈNH ĐỒNG NAI)Hà Thị Phúc, Đặng Quang Hưng, Phạm Bảo Yên,Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Vũ Minh Hạnh, PhanTuấn NghĩaKhoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên HàNội.1. MỞ ĐẦULâm trường Mã Đà thuộc tỉnh Đồng Nai là một trongnhững khu vực chịu nhiều tác động của các yếu tố môitrường khắc nghiệt, đặc biệt là các tác động của chiến tranhhoá học. Tuy vậy, cho đến nay vẫn còn rất ít công trìnhnghiên cứu về các tác động này lên các sinh vật có mặt ởđây. Trong một công trình công bố gần đây [4], chúng tôiđã phát hiện thấy có những sai khác về hoạt độ một vàienzym bảo vệ oxy hoá cũng như phổ băng ADN giữa cácmẫu ốc Bradybaena similaris thu thập được từ khu vực nàyso với mẫu ốc cùng loài thu thập được từ Vườn Quốc giaCát Tiên (Tỉnh Đồng Nai) là nơi có điều kiện sinh tháitương tự Mã Đà nhưng ít bị tác động của chiến tranh hoáhọc. Để tiếp tục đóng góp những dẫn liệu cho việc đi sâuđánh giá về tác động của điều kiện môi trường lên hệ gencác loài sinh vật ở vùng này, chúng tôi đã mở rộng nghiêncứu tìm hiểu về những khác biệt trong phổ băng ADN giữamột số loài thực vật thu thập từ hai vùng vừa nêu. Bài báonày giới thiệu một phần các kết quả thu được.2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU2.1.Nguyên liệuCác mẫu thực vật dùng cho nghiên cứu bao gồm các loài:Trung quân (Ancistocladus tectorius), Quế bì(Cinnamomum cassia), Săng mây (Segeraea elliptica) vàLộc Vừng (Barringtonia acutangula). Mẫu được thu thậpthành từng cặp loài từ Lâm trường Mã Đà và rừng Quốc giaCát Tiên, được TS. Trần Đình Nghĩa giúp định tên khoahọc.Các oligonucleotide (mồi) được mua của OperonTechnologies Inc. (Mỹ), các hoá chất còn lại dùng chonghiên cứu đều đạt độ tinh khiết phân tích.Bảng 1: Các mồi ngẫu nhiên được sử dụng trong các phản ứng RAPD2.2.Phương pháp- Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu thực vật theo quytrình của Stacey và Isaac [7] có cải tiến.- Định lượng ADN bằng đo độ hấp phụ tử ngoại ở bướcsóng 260 nm (A260)- Phân tích phổ băng ADN bằng phương pháp các đoạnADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) bằng kỹthuật PCR. Một phản ứng RAPD-PCR bao gồm đệm PCR1x và nồng độ cuối cùng của các chất thành phần là: MgCl22,5 mM, dNTPs 0,2 mM, mồi ngẫu nhiên 0,5 mM, 2,5 đơnvị Taq ADN polymerase và 10-20 ng ADN khuôn. Phảnứng được thực hiện qua 45 chu kì lặp lại của 3 bước chính:biến tính ADN khuôn ở 940C, 35 giây, gắn mồi ở 370C, 30giây và kéo dài chuỗi ở 720C, 1 phút. Sản phẩm của RAPDsau đó được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm băng bằngethidium bromide và chụp ảnh để phân tích.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU3.1. Xây dựng quy trình tách chiết ADN từ mẫu thựcvậtĐể tách chiết ADN từ các mẫu thực vật chúng tôi đã sửdụng qui trình của Stacey và Issac [7], là qui trình đã đượcdùng với nhiều đối tượng thực vật khác nhau. Tuy vậy khiáp dụng qui trình tách chiết này, chúng tôi không thu đượcADN, vì vậy chúng tôi đã thay đổi một số thành phần đệmtách chiết, cụ thể là tăng nồng độ EDTA trong hệ đệm lên50 mM nhằm loại trừ hoàn toàn tác động phân cắt ADN bởicác nuclease nội bào, tăng nồng độ NaCl từ 0,7M lên gấpđôi nhằm hạn chế sự tạo phức giữa ADN và CTAB, bổsung thêm polyvinyl pirrolidone (PVP) và sodium dodecylsulfate (SDS) để làm tăng khả năng giải phóng ADN cũngnhư tăng kết tủa một số hợp chất polyphenol, polysacharidevà protein...Qui trình tách chiết tóm tắt gồm các bước: mẫu lá đượcnghiền với nitơ lỏng, sau đó bổ sung đệm nghiền (Tris HCl100 mM, pH 8.0, EDTA 50 mM pH8.0, NaCl 1,4 M;CTAB 2%; PVP 2%; SDS 2%; beta-mecaptoethanol 2%)đã được làm nóng tới 650C. Hỗn hợp được ủ ở 650C trong 1giờ kết hợp lắc nhẹ. Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng,bổ sung một thể tích tương đương hỗn hợp phenol:chloroforrm: isoamylalcohol (trộn theo tỷ lệ 25:24:1 về thểtích), lắc mạnh mẫu trong 5 phút và ly tâm ở 6000 vòng/phút ở 250C trong 10 phút để thu phần dịch trên tủa. Bổsung tiếp 0,1 thể tích tương ứng NaCl 3M cùng hai thể tíchethanol tuyệt đối và chuyển nhanh sang ủ ở –200C trong 1giờ. Ly tâm hỗn hợp để thu tủa ADN ở 14.000 vòng/phút ở40C trong 15 phút. Hoà tan kết tủa trong TE (Tris-HCl 10mM pH 8,0 có chứa EDTA 2 mM), loại ARN bằng RNAse,tái kết tủa ADN bằng 0,7 lần thể tích isopropanol và hoàtan trở lại trong đệm TE.Kết quả đo độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm (A260) và 280nm (A280) của các chế phẩm ADN thu được (bảng 2) chứngtỏ sự có mặt của ADN, tỷ số A260/A280 của cả 4 đối tượngđạt khoảng 1,9 đến 2,1. Khi phân tích chất lượng ADNbằng điện di trên gel agarose (hình 1) cho thấy tất cả 4 mẫuthực vật chọn nghiên cứu thu ở Mã Đà hay Cát Tiên đềuchỉ chứa một băng ADN có kích thước lớn, không lẫnARN. Các kết quả phân tích về độ hấp thụ tử ngoại và điệndi khẳng định qui trình với các cải tiến ...