BÁO CÁO KHOA HỌC: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN LAI GNRH-TBK Ở E. COLI

Trichobakin (TBK) là một protein bất hoạt ribosom lớp 1, được tách chiết từ cây Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98 thuộc họ Cucurbitaceae [1,2]. Trichobakin tái tổ hợp sau khi được biểu hiện ở E.coli, đã được tinh sạch và chứng minh là có hoạt tính N- glycosidase cao đối với ARN ribosom và có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợp lucierase trên mô hình RRL (Rabbit Reticulocyte Lysate). Ngoài khả năng kháng vi khuẩn, virut, ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN LAI GNRH-TBK Ở E. COLI"NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEINLAI GNRH-TBK Ở E. COLIĐặng Thành Nam & Phan Văn Chi*Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG*Tác giả để liên hệ: Tel. 7561903; Fax. 8363144; E-mail:pvchi@ibt.ac.vn1. MỞ ĐẦUTrichobakin (TBK) là một protein bất hoạt ribosom lớp 1,được tách chiết từ cây Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98thuộc họ Cucurbitaceae [1,2]. Trichobakin tái tổ hợp saukhi được biểu hiện ở E.coli, đã được tinh sạch và chứngminh là có hoạt tính N- glycosidase cao đối với ARNribosom và có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợplucierase trên mô hình RRL (Rabbit Reticulocyte Lysate).Ngoài khả năng kháng vi khuẩn, virut, chúng còn có khảnăng gây ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro[3]. Để có thể có những ứng dụng hiệu quả hơn,Trichobakin có thể được gắn thêm thành phần hướng đíchđể tạo các protein lai theo dạng các “độc tố miễn dịch”(ITs) nhằm tiêu diệt một cách chọn lọc các quần thể tế bàomà ở đó có biểu hiện các thụ thể đặc hiệu của thành phầnhướng đích bằng công nghệ ADN tái tổ hợp [ 4, 5].Hormon giải phóng kích dục tố (GnRH) hay hormon giảiphóng thể vàng (luteinizing hormone-releasing hormone:LH-RH) là một neuro-decapeptide, không gây đáp ứngmiễn dịch và có ái lực rất cao (Kd khoảng 10-9 M) với thụthể của GnRH(GnRHR) [6, 11]. GnRHR được biểu hiệnnhiều trên bề mặt tế bào ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt,tuyến tuỵ[7-10]. Mặt khác ở các tế bào ung thư mangGnRH receptor thường có biểu hiện loại “death receptor”Fas[12]. Sự liên kết giữa GnRH (hoặc dẫn xuất ) với GnRHreceptor sẽ kích hoạt sự biểu hiện của Fas ligand, gây raquá trình appotosis cho tế bào[13]. Do vậy GnRH đượcxem như là một tác nhân hướng đích lý tưởng, GnRH đãđược sử dụng trong một số độc tố miễn dịch tái tổ hợp khácnhau như recombinant GnRH-PAP fusion toxin. Trong đóPAP cũng là một protein bất hoạt ribosome được tách chiếttừ cây Phytolacca americana. GnRH-PAP đã có khả năngức chế đặc hiệu các tế bào ung thư có biểu hiện các GnRHreceptor bề mặt[6].Trong báo cáo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứutạo protein lai GnRH-TBK được thiết kế dựa trên sự liênkết đoạn gen mã hoá cho GnRH ở người và trình tự gen mãhoá cho TBK bằng công nghệ ADN tái tổ hợp.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1 Vật liệu và hoá chấtCác hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử đượcmua từ các hãng Sigma, Bio-Rad, Pharmacia-Biotech... Cácenzym giới hạn BamHI, NcoI, enzym ghép nối T4 ADNligase, Taq ADN polymerase được mua từ hãng NewEngland Biolabs (Anh). Vector biểu hiện pET 21d(+),chủng vi khuẩn E.coli BL 21 (DE3) được mua của hãngNovagen (Mỹ).2.2 Phương pháp2.2.1 Nhân gen gnrh- tbk bằng kỹ thuật PCRViệc thiết kế gen lai gnrh- tbk được tiến hành trên cơ sởgen tbk đã được tách dòng pQV 20 [1]. Gen mã hoá choGnRH của người được nối với gen mã hoá cho Trichobakinthông qua một polynucleotid trung gian mã hoá cho 13 axitamin (linker), có vai trò tạo nên sự mềm dẻo trong cấu trúcvà tính tan của protein lai HSP1. Tổ hợp gen này có kíchthước 813 bp mã hoá cho protein có kích thước khoảng 30kDa. Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để tạo ravà nhân lên tổ hợp gen mã hóa cho protein lai GnRH-TBK.Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC, 48 giây; 56oC, 48giây; 72oC, 84 giây; lặp lại 32 chu kỳ; 72oC, 8 phút.2.2.2 Thiết kế vector biểu hiện protein tái tổ hợpVector pET-21d(+) (Novagen) và sản phẩm PCR cùngđược xử lý bằng hai enzym giới hạn NcoI, BamHI và đượcnối với nhau nhờ T4 ADN ligase tạo thành plasmid tái tổhợp pGnRH-TBK. Việc xác định trình tự ADN được tiếnhành trên máy ALF express DNA Sequencer và ThermoSequenase Cycle Sequencing Kit (Amersham PharmaciaBiotech).2.2.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩnE.coliPlasmid tái tổ hợp mang gen gnrh-tbk được biến nạp vàochủng tế bào khả biến E.coli BL21(DE3) và nuôi trong môitrường LB lỏng có bổ sung ampicillin ( nồng độ cuối cùnglà 100g/ml), lắc 200 vòng/ phút ở 37C,. Khi giá trịOD600nm của dịch nuôi cấy đạt tới 0.5-0.7, tiến hành cảmứng bằng IPTG (isopropyl - D- thiogalactoside) với nồngđộ cuối cùng là 0.4 mM. Các mẫu tế bào được thu vào cácthời điểm 0 h, 1h, 2h, 3h sau khi cảm ứng và 3h không cảmứng. Sự biểu hiện protein lai tái tổ hợp được phân tích bằngSDS-PAGE theo Laemmli [14] và Western blot theoTowbin [15].3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Thiết kế vector biểu hiện protein lai GnRH-TBK3.1.1 Nhân gen mã hoá cho GnRH- TBKDựa trên trình tự các gen mã hoá cho các protein GnRH vàTBK cặp mồi phục vụ cho việc tạo ra và nhân gen tái tổhợp gnrh-tbk bằng kỹ thuật PCR đã được tổng hợp. Mồixuôi mang vị trí nhận biết của enzym giới hạn NcoI, toànbộ trình tự gen gnrh, trình tự đoạn linker và trình tựnucleotid mã hóa cho 8 acid amin đầu tiên của TBK. Mồingược mang vị trí nhận biết của enzym giới hạn BamHI vàtrình tự nucleotidd mã hoá cho 7 acid amin cuối cù ...