BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076

S. enteritidis hiện nay vẫn được xem là nguyên nhân gây bệnh quan trọng nhất trong số các chủng Salmonella. Ở nước ta, bệnh do Salmonella chiếm tỷ lệ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁ CHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,M CỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC13076"PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN GM1 MÃ HOÁCHO EPITOPE THUỘC KHÁNG NGUYÊN H: G,MCỦA SALMONELLA ENTERITIDIS ATCC130761 Đỗ Thị Huyền, 2Nguyễn Thành Trung, 2Nguyễn ThịThu Hằng, 1Phạm Thuý Hồng, 3Trương Văn Dung,1 Trương Nam Hải, 2Lê Đình Lương1: Viện Công nghệ sinh học, 2: Đại học Quốc gia Hà Nội 3:Viện Thú Y Trung ƯơngMỞ ĐẦUSalmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăncho người trên toàn cầu. Theo số liệu thống kê của Phápnăm 1995, trong số 7449 bệnh nhân bị nhiễm độc thức ănđã có tới 3131 bệnh nhân do Salmonella gây ra. Bệnh doSalmonella tập trung chủ yếu ở các nước châu Âu, châu Mỹđiển hình là Anh, Pháp, Mỹ, Hà Lan [1, 2]. S. enteritidishiện nay vẫn được xem là nguyên nhân gây bệnh quantrọng nhất trong số các chủng Salmonella.Ở nước ta, bệnh do Salmonella chiếm tỷ lệ ít hơn và chủnggây bệnh chủ yếu là S. typhimurium, S. cholera sau đó đếnS. enteritidis. Thông thường bệnh không gây triệu chứngnặng đối với người lớn nhưng lại gây triệu chứng nghiêmtrọng đối với người già, người yếu và trẻ em.Người bị mắc bệnh là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc từthịt động vật, gia cầm và trứng đã nhiễm Salmonella. Hiệnnay mỗi nước đều có chương trình an toàn thực phẩm vàkhuyến cáo để phòng bệnh do Salmonella nhưng hầu nhưvẫn chưa loại trừ được mầm bệnh một cách triệt để [1].Một trong những phương pháp để hạn chế sự lây lan củamầm bệnh là phải có phương pháp phát hiện nhanh, tiệnlợi, chính xác để phát hiện ra nguồn gia súc, gia cầm nhiễmbệnh.Hiện nay có nhiều phương pháp phát hiện Salmonella [1, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9]. Phương pháp được sử dụng rộng rãi làphương pháp ELISA dùng kháng nguyên để phát hiện sựtồn tại của kháng thể kháng Salmonella trong huyết thanh[1, 4, 6, 7, 8]. Tuy nhiên, kháng nguyên sử dụng trong cácphương pháp này đều mới là kháng nguyên toàn vẹn đượctinh chế bằng phương pháp hoá học và lý học nên tính đặchiệu chưa cao. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi mongmuốn tạo được epitope của kháng nguyên H:g,m có khảnăng phát hiện đặc hiệu S. enteritidis bằng công nghệ ANDtái tổ hợp.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Nguyên liệua, Chủng vi sinh vật- Chủng S. enteritidis ATCC13076 là chủng vi khuẩn mangnguồn gen gm1 do Viện Thú Y Trung Ương cung cấp.- Chủng E. coli DH5 [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gypA96 thi-1 relA1 lac U169 (80 lacZM15)] được sử dụnglàm thể nhận trong thí nghiệm biến nạp, nhân và chọn dòngcác plasmit.- Chủng E. coli BL21 [F-omp hsd SB (rBmB) gel dcm(DE3) plysS (Caml)] được sử dụng làm chủng nhận trongthí nghiệm biến nạp với vectơ biểu hiện pET22b(+) manggen gm1.b, Plasmit- Plasmit pCR2.1 mua của hãng Invitrogen được sử dụnglàm vectơ tách dòng gen.- Plasmit pET22b(+) được sử dụng làm vectơ biểu hiệntrong tế bào E. coli BL212. Phương phápa, Phương pháp biến nạpTế bào E. coli được biến nạp theo phương pháp tạo tế bàokhả biến bằng muối CaCl2 của Seidman C. E. và cộng sự[10]b, Các phản ứng cắt, nối ghép các đoạn ADN, điện di trêngel agaroza được tiến hành theo Sambrook và cộng sự [11]c, Phản ứng PCRPhản ứng làm biến tính ADN khuôn diễn ra ở 940C trong 2phút sau đó được tiếp theo với 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồmba bước: bước 1: biến tính sợi ADN khuôn ở 940C trong 1phút; bước 2: mồi kết cặp bổ sung với đoạn gen tương đồngtrên sợi khuôn ở 490C trong 1 phút; bước 3: tổng hợp, kéodài chuỗi ở 720C trong 40 giây. Phản ứng kết thúc ở 720Ctrong 5 phút và ủ mẫu ở 40C.Hai đoạn mồi dùng để nhân gen do hãng AmershamPharmacia Biotech tổng hợp có trình tự như sau:gm1f: TCCATggATgAAgCCAAAgCgATAgCTggT NcoIgm1r: ACTCgAggTTTTTggTTTTATCATCAAA XhoI Hình 1: Phân tích ADN hệ gen S. enteritidis ATCC13076 trên gel agaroza 0,8% Đường chạy 1: Hệ gen S. enteritidis ATCC13076 Đường chạy 2: Thang ADN chuẩn d, Tách ADN hệ gen của S. enteritidisMột khuẩn lạc của S. enteritidis được nuôi cấy lắc trong 10ml môi trường LB ở 370C qua đêm. Sau đó tế bào được thulại bằng ly tâm và được hoà tan vào 567 l TE (10 mMTris, 1 mM EDTA, pH8). Mẫu tế bào được bổ sung thêm30 l SDS 10%, 3 l proteaza K 1% và ủ ở 370C trong 1giờ sau được bổ sung thêm 180 l NaCl 5 M và ủ ở 650Ctrong 10 phút. Protein của tế bào được loại bỏ bằngChloroform. ADN hệ gen nằm ở pha trên được tủa lại bằngcồn và được hoà vào 40 l TE có bổ sung 0,4 lARNaza1%. ADN hệ gen được bảo quản ở 40C.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1. Nhân gen gm1 bằng kỹ thuật PCRS. enteritidis có 3 kháng nguyên quan trọng được sử dụngđể phát hiện sự có mặt của chúng trong huyết thanh làkháng nguyên O, H và kháng nguyên lông. Trong số cáckháng nguyên này, kháng nguyên H và kháng nguyên lônglà đặc hiệu hơn cho S. enteritidis. Kháng nguyên H của S.enteritidis chỉ có một tính đặc hiệu là H:g,m được mã hoábởi gen fliC. Kháng nguyên H đ ...