BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM

Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOMPHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢNĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUMTRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDGEN 16S-ARN RIBOSOMNguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh,Lê ThanhHoà, Nguyễn Ngọc DũngViện Công nghệ Sinh học.Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở ViệtNam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vữngsinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thựchiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồngbằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong nhữngnăm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000). Một trongnhững nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khaithác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúngđược coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chốngvi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992,Berg và cộng sự, 2000). Các chủng pseudomonad sinhhuỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọctheo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhângây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung vàcộng sự, đang in).Do có những đặc điểm riêng hình thành trong trong suốtqúa trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARNribosom (ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen16S- và 23 S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trongviệc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa cácchủng vi khuẩn ( Woese, 1987). Theo Ludwig và Schleifer( 2000) đã có tới hơn 16000 gen 16S-ARNr từ các chủng vikhuẩn đã được xác định trình tự nucleotid.Trong bài báo này, vị trí phân loại của chủng Ps7-1 sẽ đượctrình bày trên cơ sở phân tích trình tự nucleotid gen 16S-ARN ribosom (16S-ARNr). I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Vi sinh vật:Chủng phân lập Ps7-1 có nguồn gốc từ đất bám rễ cây lúa ởKim Chung, Đông Anh, Hà Nội và cho khả năng đối khángF. oxysporium cao trong điều kiện in vitro (Nguyễn ThịTuyết Nhung và cộng sự, đang in) và chủng E. coli DH đãđược sử dụng.2. Các phương pháp phân loại:a. Phương pháp phân loại theo kiểu hình:Phương pháp phân loại vi khuẩn được chuẩn hoá API20NE (BioMerieux Marcy, Pháp) đã được sử dụng. Theonhà cung cấp, hệ thống API 20NE chỉ dùng để phân loạicác nhóm vi khuẩn hình que, gram âm, không thuộc HọEnterobacteracae. Ngoài các đặc tính theo API 20NE, cácđặc điểm kỵ khí không bắt buộc và kháng tetraxyclin đãđược xác định. Đặc điểm kỵ khí không bắt buộc được tiếnhành theo phương pháp cấy thẳng đứng vào môi trường LBrắn có chiều cao 10 cm trong ống nghiệm; mẫu được ủ ở30oC và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờ ủ. Tínhmẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiến hành theophương pháp Krieg và Doebereiner (1984). Theo đó, tế bàoPs7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LB rắn, sauđó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịch tetraxyclinlên trên. Chủng E. coli DH5 được sử dụng làm đối chứng.Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh đĩa giấythấm sau 24 giờ ủ.b. Phương pháp phân loại theo kiểu gen:-Thu ADN tổng số:ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Mastersonvà cộng sự (1985).-Thu nhận gen 16S-ARNr:Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bản gen(PCR) với cặp mồi có trình tự như sau. Mồi thuận chiềuPrf: 5-GAGTTTGATCATGGCTAA-3, tương ứng với cácvị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E. coli; mồinghịch chiều Prr: 5- AGGAGGTGATCCAGCC-3, tươngứng với các vị trí 1540-1524 từ E. coli, do Genset-OligosSingapore, cung cấp. Hỗn hợp phản ứng nhân bản gen cóthể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion, 2,5 lđệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0 l dịchmồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0 l dịchADN khuôn và 0,3 l Taq Polymerase. Phản ứng đượcthực hiện với chu trình nhiệt như sau: Giai đoạn đầu, ADNđược biến tính ở 95oC trong 1 phút 30 giây, tiếp tục biếntính ở 94oC trong 1 phút, kế tiếp mồi được gắn ở nhiệt độ52oC và phản ứng kéo dài chuỗi ở 72oC trong 1 phút 20giây. Giai đoạn chính được lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt cơbản giống ở giai đoạn đầu, chỉ khác ở chỗ ADN được biếntính một lần ngay ở nhiệt độ 94oC trong 1 phút, tiếp sau phacuối cùng phản ứng kéo dài chuỗi được duy trì ở 72oCtrong 10 phút và sản phẩm được bảo quản ở 4oC.Kết qủa phản ứng được kiểm tra bằng điện di agarose0,8%. Sản phẩm nhân bản gen được gắn vào vectơ pCR2.1theo chỉ dẫn của nhà cung cấp TA Cloning Kit, Invitrogen.Vectơ pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạpvào dòng tế bào INVaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phươngpháp kháng sinh và chỉ thị màu (SAMBROOK vàRUSSELL, 2001). ADN plasmid tái tổ hợp được tách chiếtvới bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit(QIAGEN Inc.). Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tratrên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid táitổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI.3. Giải trình trình tự chuỗi nucleotid và xử lý số liệu:Chuỗi ADN được giải trình tự trên máy giải trình tự ...