BÁO CÁO KHOA HỌC: PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP VENT ADN POLYMERASE

Haemophilia A (bệnh máu khó đông) là một trong những bệnh di truyền phổ biến liên quan đến nhiễm sắc thể X. Ước tính trên thế giới có khoảng từ 1/5000 đến 1/10.000 các bé trai sinh ra mắc bệnh này.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP VENT ADN POLYMERASE"PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA ABẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEPVENT ADN POLYMERASENguyễn Hoài GiangViện Vệ sinh Dịch tễ Trung ươngNguyễn Tùng LâmTrường Đại học Ngoại ThươngĐẶT VẤN ĐỀHaemophilia A (bệnh máu khó đông) là một trong nhữngbệnh di truyền phổ biến liên quan đến nhiễm sắc thể X.Ước tính trên thế giới có khoảng từ 1/5000 đến 1/10.000các bé trai sinh ra mắc bệnh này. Theo số liệu thống kê củaViện Huyết học và Truyền máu Trung ương số lượng bệnhnhân Haemophilia A ở Việt nam cũng không phải là nhỏ.Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh Haemophilia Alà do các đột biến ở gen mã hoá cho yếu tố đông máu sốVIII (factor VIII). Gen này nằm trên cánh dài của nhiễmsắc thể tại vị trí Xq28. Gen mã hoá cho yếu tố VIII rất lớn(khoảng 180 kb) bao gồm 26 exon (1). Kỹ thuật PCR dùngTaq ADN polymerase, sau đó phát hiện điểm đột biến bằngenzyme giới hạn (PCR-RFLP) đã được các nghiên cứutrước đây sử dụng rất có hiệu quả để phát hiện các đột biếncủa bệnh Haemophilia A(1, 2).Deep Vent ADN polymerase có hoạt tính xúc tác quá trìnhtổng hợp ADN mới như Taq ADN polymerase. Các nghiêncứu của hãng New England Biolab cho thấy Deep VentADN polymerase có nhiều ưu điểm hơn so với Taq ADNpolymerase. Ở 95oC, Taq ADN polymerase bị mất 50%hoạt tính xúc tác sau 40 phút so với 1380 phút cùng điềukiện của Deep Vent ADN polymerase. Deep Vent ADNpolymerase lại ít gây lỗi khi xúc tác tổng hợp sợi ADN mớiso với Taq ADN polymerase (3, 4). Những đột biến ởintron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII là đột biếnmất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I và HindIII(1, 2). Do vậy, độ chính xác của các sản phẩm PCR sovới khuôn mẫu ADN ban đầu rất quan trọng, nó đảm bảokết quả chẩn đoán phát hiện đột biến ở bệnh nhânHaemophilia A. Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn sửdụng ưu điểm ít gây lỗi trong quá trình xúc tác của DeepVent ADN polymerase để sử dụng kỹ thuật PCR-RFLPphát hiện các đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoácho yếu tố đông máu số VIII. Kỹ thuật này có thể ứng dụngđể phát hiện các phụ nữ mang gen bệnh và chuẩn đoán sớmtrước sinh bệnh Haemophilia, phục vụ chương trình chămsóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệu19 mẫu máu của bệnh nhân Haemophilia A do Viện Huyếthọc và Truyền máu Trung ương cung cấp. 25 mẫu máu củangười bình thường khoẻ mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễTrung ương cung cấp. Taq ADN polymerase, Deep VentADN polymerase, các enzyme giới hạn Bcl I và Hind III vàthang ADN chuẩn 100bp của hãng New England Biolabs(Mỹ). Các hoá chất khác sử dụng cho nghiên cứu này đềucủa các hãng Sigma, Merck, Promega…Phương pháp nghiên cứu Tách chiết ADN từ máu được cải tiến theo phương•pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (5). Phản ứng PCR sử dụng enzyme Taq ADN polymerase,•với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và 19 của yếu tố VIIIđược tiến hành theo nghiên cứu của Kogan và cộng sự (2). Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và•19 của yếu tố VIII, sử dụng enzyme Deep Vent được tối ưutheo theo phương pháp nghiên cứu được mô tả bởi NguyễnHoài Giang và các đồng tác giả (6). Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Bcl I và Hind•III theo thường qui chuẩn của hãng New England Biolabs(4). Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% và•nhuộm bạc theo phương pháp của Sambrook và cộng sự(5).KẾT QUẢ, THẢO LUẬN1. Phát hiện đột biến ở intron 18 của gen mã hoá choyếu tố đông máu số VIII0,5 ml của 44 mẫu máu (19 mẫu của bệnh nhânHaemophilia A và 25 mẫu của người bình thường khoẻmạnh) được tách chiết ADN bằng đệm phân giải, đệm phângiải nhân, proteinase K và kết tủa ADN bằng isopropanol,theo phương pháp đã cải tiến của Sambrook và cộng sự (5).Kết quả đo OD ở bước sóng 260 nm cho thấy tất cả cácmẫu ADN tách chiết được đều đủ điều kiện để tiến hànhphản ứng PCR. Sủ dụng điều kiện PCR dùng Taq ADNpolymerase cho cặp mồi của intron 18, gen mã hoá yếu tốVIII theo Kogan và cộng sự (30 chu kỳ với 94oC-1 phút,45oC-1 phút, 72oC -1 phút), chúng tôi đã thành công trongviệc khuyếch đại intron này từ các mẫu ADN của ngườikhoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia A (giếng 1 , Hình1). Theo nghiên cứu của hãng New England biolabs vàkinh nghiệm của chúng tôi về Deep Vent ADN polymerase(4, 6), điều kiện PCR với Deep Vent ADN polymerase chocặp mồi của intron 18 sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ với94oC-30 giây, 50oC-20 giây, 72oC-20 giây; 2 mM Mg2+;200 àM dNTPs. Kết quả điện di trên gel polyacrylamide6% cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu chointron 18 có kích thước 142 bp ở cả người bình thườngkhoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia, giống như kết quảcủa Kogan và cộng sự (giếng 1 đến 3, Hình 1). Theo nghiêncứu trước đây (1, 2), đột biến ở intron 18 sẽ làm thay đổi vịtrí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I. Nghĩa là nhữngbện ...