Báo cáo khoa học: PHÁT TRI ỂN QUI TRÌNH MRT-PCR PHÁT HI ỆN GAV (Gill-associated virus) VÀ BETA–ACTI N Ở TÔM SÚ

RT-PCR giao thức được phát triển để phát hiện GAV và Beta-actin gen nội sinh của tôm sú Penaeus monodon. Sáu mẫu GAV tích cực đã được phát hiện bởi IQ2000 YHV / GAV giao thức được sử dụng để thử nghiệm với giao thức của Cowley et al. (2000).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo khoa học: " PHÁT TRI ỂN QUI TRÌNH MRT-PCR PHÁT HI ỆN GAV (Gill-associated virus) VÀ BETA–ACTI N Ở TÔM SÚ" Tạ p chí Khoa họ c 2008 (1): 176-180 Tr ường Đạ i họ c Cần Th ơ PHÁT TRI ỂN QUI TRÌNH MRT-PCR PHÁT HI ỆN GAV (Gill-associated virus) VÀ BETA–ACTI N Ở TÔM SÚ Trầ n Việt Tiên 1, Trần Th ị Mỹ Duyên1 và Đặng Th ị Hoàng Oanh 1 ABS TRACT Multiplex RT-PCR protocol was developed to detect GAV and Beta-actin endogenous gene of black tiger shrimp Penaeus monodon. Six GAV positive samples which were detected by IQ2000 YHV/GAV protocol were used to test with protocol of Cowley et al. (2000). The multiplex RT-PCR was then developed in combination of protocol for beta actin detection of Oanh ( 2007) to obtain PCR products of 317 bp for GAV and 216 bp for beta actin. This optimized protocol can now be used for GAV detection in P. monodon in our laboratory. K eywords: GAV, RT-PCR, Penaeus monodon Title: Development of multiplex RT-PCR to detect GAV and beta actin of Penaeus monodon TÓM TẮT Qui trình đ ược th ực hiện nh ằm ứng dụ ng ph ương pháp RT-PCR đ ể phát hiện GAV trên tôm sú giống có sử d ụng nộ i chu ẩn Beta-actin. Sáu mẫu d ương tính với GAV phân tích b ằng kit IQ2000 YHV/GAV đ ược ch ọn đ ể th ực hiện qui trình phát hiện GAV củ a Cowley et al. (2000). Sau đó kết h ợp qui trình RT-PCR củ a Cowley et al., (2000) và qui trình RT-PCR phát hiện gen Beta-actin của Oanh (2007) phát hiện đ ồng thời gen Beta-actin củ a tôm (216 bp) và GAV (317 bp). Qui trình đ ược chuẩn hoá có th ể ứng d ụng trong nghiên cứu và xét nghiệm GAV trên tôm sú tạ i Khoa Th ủ y sản. Từ khóa: GAV, RT-PCR, Penaeus monodon 1 GIỚ I THIỆU Sự p hát triển nhanh của nghề nuôi tôm đã đ em l ại l ợi ích đáng kể v ề mặt kinh t ế và xã hội. Tuy nhiên nghề nuôi tôm hi ện đang phải đương đầu v ới nhi ều lo ại b ệnh xuất hiện trong quá trình nuôi tôm nhất là bệnh do vi-rút gây ra như vi-rút gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome sirus - WSSV), vi-rút gây hội chứ ng Taura (Taura syndrome virus - TSV), vi rút gây bệnh đ ầu vàng (yellow head virus - YHV) và vi rút gây bệnh mang (gill- associated virus - GAV). Do chư a có thuốc chữ a trị đặ c hi ệu nên công tác phòng ngừ a và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truy ền thống như quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh học không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp phân t ử như lai in situ, western blot, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục nhữ ng nhược điểm trên. Phương pháp PCR hiện đang được sử dụng rất rộng r ải và hiệu qu ả t rong vi ệc xét nghi ệm tôm giống. Tuy nhiên một trong nhữ ng h ạn ch ế đáng kể của PCR là hiện t ượng âm tính giả. Trong số các qui trình PCR phát hiện vi-rút trên tôm được sử dụng thường không có nội chuẩn nhằm kiểm soát trường hợp âm tính giả. Để t ừ ng bước khắc phục vấn đề này và cũng để t hự c hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV t ại Khoa Thủy sản chúng tôi phát triển qui trình mRT-PCR phát hiện đồng thời GAV và gen Beta-actin củ a tôm sú để xác định các trường hợp âm tính giả v à nâng cao tính chính xác của qui trình xét nghi ệm. 1 B ộ Môn Sinh học và B ệnh thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học C ần Thơ 176 Tạ p chí Khoa họ c 2008 (1): 176-180 Tr ường Đạ i họ c Cần Th ơ 2 PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U 2.1 Vật li ệu nghiên cứu Một trăm sáu mươi chín mẫu tôm giống cỡ Pl 12-15 được xét nghiệm t ại Khoa Thủy sản từ t háng 02–05/2007 bằng phương pháp PCR hai bước sử dụng kit IQ2000 YHV/GAV. M ẫu tôm được thu và vận chuyển trong túi nilon 2 lớp có bơm oxy mỗi túi có 100-200 tôm giống. Thao tác ly trích ARN và khuếch đại phát hiện GAV được thự c hiện theo qui trình hướng dẫn của Công ty Farming Intelligene Technology Corperation, Đài Loan. N guồn vi-rút sử dụng làm đối chứ ng dương được ly trích từ t ôm nhiễm GAV ở Úc. 2.2 Q ui trình RT- PCR phát hi ệ n GAV M ẫu tôm dương tính với GAV theo kit IQ2000YH V/GAV được sử dụng đ ể t hự c hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV theo Cowley et al., (2000). 2.2.1 Ly trích ARN Cho 50-100 mg mẫu vào ống eppendorf 1,5 ml có chứ a 750 µl Trizol (Invitrogen). Nghiền mẫu và giữ ở nhi ệt độ p hòng 5 phút. Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút để t ạo phần viên. Chuy ển dịch trong sang một ống eppendorf mới. Thêm 200 µl chloroform/1ml 0 Trizol. Lắc c ẩn thận bằng tay trong 15 giây. Ủ ở 15-30 C t ừ 2-3 phút. Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút. Chuy ển phần trong phía trên sang một ống eppendorf 1,5 ml mới. 0 Thêm 500 µl isopropanol/1ml Trizol. Ủ ở 15-30 C t rong 10 phút. Ly tâm 12.000 vòng 10 phút, sau đó rút bỏ isopropanol. Rử a phần viên bằng ethanol 75 % (sử sụng 1ml ethanol 75% cho 1ml Trizol). Trộn đều bằng vortex và ly tâm 7.500 vòng trong 5 phút, sau đó 0 làm khô phần viên. Hòa tan phần viên với 40 µl nước cất và trữ ở -80 C. 2.2.2 Tạo cDNA: Chuẩn bị hỗn hợp phản ứ ng RT-PCR - Hỗn hợp A: ARN được ly trích t ừ mẫu tôm bệnh được đo và pha loãng ở hàm lượng 200 ng/µl. Thành phần hóa chất hỗn hợp A gồm có 0,5 µl dNTP (10mM ) ; 1 µl mồi random hexamer (50 ng/µl); 5 µl ARN (200ng/µl) ; 0,5 µl nướ c c ất. Hỗn hợp được ủ 0 0 0 65 C t rong 5 phút, sau đó giữ t rong nước đá 5 phút rồi để ở nhiệt độ 20 C – 25 C. - Hỗn hợp B: Thành phần hóa chất gồm có 2 µl dung dịch đệ m 5X; 0,5 µl DDT và 0,5 µl supper reverse transcriptase III. Hỗn hợp được ủ 420C trong 5 phút, sau đó giữ ở 0 0 0 nhiệt độ 20 C – 25 C trong 5 phút rồi giữ ở 4 C. ...