BÁO CÁO KHOA HỌC: SO SÁNH ĐA HÌNH AFLP GIỮA HAI NHÓM CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) CÓ TRỌNG LƯỢNG PHÂN BIỆT

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có giá trị kinh tế cao và được nuôi trồng phổ biến ở khu vực Đông nam á [4]. ở Việt Nam, cá tra được nuôi nhiều ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Thời gian gần đây, cá được di giống thuần hoá nuôi ở một số tỉnh phía Bắc.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "SO SÁNH ĐA HÌNH AFLP GIỮA HAI NHÓM CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) CÓ TRỌNG LƯỢNG PHÂN BIỆT"SO SÁNH ĐA HÌNH AFLP GIỮA HAI NHÓM CÁTRA (Pangasius hypophthalmus) CÓ TRỌNG LƯỢNGPHÂN BIỆT.Nguyễn Thu Thuý, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn VănCườngViện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệViệt NamMỞ ĐẦUCá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có giá trị kinhtế cao và được nuôi trồng phổ biến ở khu vực Đông nam á[4]. ở Việt Nam, cá tra được nuôi nhiều ở các tỉnh Đồngbằng sông Cửu Long. Thời gian gần đây, cá được di giốngthuần hoá nuôi ở một số tỉnh phía Bắc. Cá thương phẩm cógiá trị trên thị trường cả trong và ngoài nước. Hiện cả nướccó trên 14 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra, ba sa với kimngạch hàng năm trên 60 triệu USD [7]. Nâng cao hiệu suấtnuôi trồng để tăng lợi nhuận luôn là mục tiêu của các nhàsản xuất. Bên cạnh những nghiên cứu nhằm tăng hiệu quảsinh sản, dinh dưỡng, việc cải tạo giống để tạo những dòngcá có năng suất cao được chú trọng. Chương trình lai tạo,chọn giống truyền thống luôn đóng vai trò chủ đạo trongcải tạo giống. Tuy nhiên, để nâng cao hiệu quả chọn lọc,trong thời gian gần đây, nghiên cứu lập bản đồ gen và pháttriển chỉ thị di truyền phân tử được chú ý phát triển. ở cánheo Mỹ (Ictalurus punctatus) đã xác định được 19 chỉ thịphân tử loại I, 243 các chỉ thị phân tử loại II, 1 chỉ thị EST[8]. Trong số các phương pháp di truyền phân tử, AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism ) là phươngpháp có nhiều ưu điểm, đặc biệt cho phép tuyển chọn đồngthời trên toàn bộ hệ gen và tạo ra một số lượng lớn chỉ thịcó thể chuyển đổi thành chỉ thị đặc hiệu vị trí đơn giản(simple locus-specific markers) mà không cần biết trướcthông tin của trình tự đặc hiệu đó. Phát triển chỉ thị AFLPliên quan tính trạng quan tâm có thể dựa trên sự phân bốngoại hình của hai quần thể đối lập nhau [2] hoặc dựa trênđa hình di truyền ở hai nhóm cá thể đối lập nhau [5].Phương pháp sau có ưu điểm không cần thiết lập bản đồ ditruyền và tạo ra các phả hệ đặc biệt, nên thích hợp cho pháthiện vị trí tính trạng định lượng (QTL) trực tiếp từ các quầnđàn thương phẩm có tuổi thành thục dài như cá tra (2-3năm). Với mục đích phát triển chỉ thị AFLP trực tiếp từquần đàn thương phẩm, chúng tôi tiến hành phân tích đahình AFLP giữa hai nhóm cá tra có trọng lượng cực lớn vàcực nhỏ.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPNguyên liệu:Mẫu cá tra được thu từ trung tâm Cái Bè – Tiền Giang,được bảo quản trong cồn 700, ở 40C cho đến khi sử dụng(Mẫu do Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I cung cấp).Từ 282 mẫu cá, chọn 10 mẫu có trọng lượng lớn nhất(trung bình là 3,9 gam) và 10 mẫu có trọng lượng nhỏ nhất(trung bình là 2,2 gam).Tách chiết ADN:ADN cá tra được tách chiết chủ yếu theo Fetzner [3]. Cụthể: khoảng 50 mg mẫu được rửa sạch cồn bằng 0,9 ml đệmTLE (10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8.0). Thêm vào 0,9ml đệm phá tế bào (10 mM Tris; 100 mM EDTA; 2% SDS,pH 8.0). Bổ sung 5µl enzyme protease K (20 mg/ml), ủ550C trong 14-16 giờ. Để mẫu ở nhiệt độ phòng và bổ sung4µl RNAase A (10mg/ml), ủ 370C trong 30 phút. Thêm vào0,3 ml dung dịch kết tủa protein (7,5 mM AmmoniumAcetate), trộn đều và ủ trong đá 30 phút. Ly tâm 2 lần đểloại tủa protein và thu dịch ADN. Kết tủa ADN bằng 0,9 mlisopropanol, để -200C trong 3 giờ, ly tâm thu tủa ADN. RửaADN bằng 0,75 ml cồn 700 . Hòa tan ADN trong 100µlđệm TLE. Bảo quản ở 40C để sử dụng cho các thí nghiệmtiếp theo.Kỹ thuật AFLP:AFLP cơ bản được tiến hành theo Liu và cs [6]. Các bướcchính của phương pháp được tóm tắt như sau: ADN đượccắt bằng 2 enzyme EcoRI và MseI: 300 ng ADN, 3Uenzyme EcoRI và MseI ở 370C trong 2 giờ. Sau đó, cácđoạn ADN cắt ra được gắn vào các adapter của EcoRI vàMseI nhờ enzyme T4 ADN ligase trong 3 giờ ở 200C. Cácđoạn ADN tạo ra trước hết được khuếch đại bằng PCR sửdụng mồi tiền chọn lọc (preselective primer) sau đó là mồichọn lọc (selective primer)Bảng 1: Trình tự các adapter và mồi được sử dụng trong phân tích AFLPPhân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, một thể tíchformamide dye được thêm vào phản ứng. Mẫu được biếntính bằng nhiệt ở 950C trong 3 phút, và đặt ngay vào đá.Sản phẩm AFLP được điện di trên gel polyacrylamide biếntính (19:1 acrylamide:bisacylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBEbuffer ). Bản gel được cố định trong axit axêtic 10%,nhuộm trong bạc nitơrat 1%, hiện trong natricacbônat 2,5%và cố định lại trong axit axêtic 10% [1].KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNADN hệ gen từ hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn và nhỏđược tách chiết. Kết quả đánh giá trên điện di agarose chothấy chất lượng ADN đạt tiêu chuẩn cho các phân tích tiếptheo.Để chuẩn bị khuôn ADN cho AFLP, ADN hệ gen được cắtđồng thời bởi 2 enzyme giới hạn EcoRI có trình tự nhậnbiết 6 base pair (G(AATTC) và MseI có trình tự nhận biết 4base pair (T(TAA). Thành công của kỹ thuật AFLP phụthuộc vào sự cắt hoàn toàn của phản ứng cắt và chất lượngADN. Các đoạn ADN tạo ra được gắn ...