BÁO CÁO KHOA HỌC: SỬ DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC PROTEIN

Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọng nhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phân chia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "SỬ DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG NGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC PROTEIN"SỬ DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONGNGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC PROTEINDương Văn HợpTrung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà nộiSokolenko, R.G.HermannViện CNSH Thực vật. Đại học Tổng hợp Munich.Đức.I. GIỚI THIỆU: Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan trọngnhằm xác định chức năng và sự tham gia của chúng vàomột hay nhiều hoạt động sống cụ thể như quá trình phânchia tế bào, sao chép DNA, tổng hợp protein hay vậnchuyển tín hiệu. Trên thực tế có nhiều phương pháp khácnhau dùng cho nghiên cứu tương tác protein như; sắc kí áilực (Affinity chromatography), kết tủa miễn dịch (Immunopricipitate) , tạo liên kết chéo ( Cross-linking).Phương pháp sắc ký ái lực được thực hiện như sau:proteinnghiên cứu được cố định trên một chất mang ( ví dụ:agarose, Sephadex). Sau đó mẫu chứa protein tương tácđược cho đi qua cột và chúng bị giữ lại. các protein bámnày được tách ra khỏi cột bằng các dung dịch thích hợp như: SDS, muối NaCl, dung môi hữu cơ. người ta đã sử dụngphương pháp này để tách các protein tương tác với RNAazatừ 25 năm trước đây. (1).Phương pháp kết tủa miễn dịch dựa vào phản ứng khángnguyên với kháng thể. ở đây người ta dùng chất mang(Sepharose) gắn với protein A tương tác với kháng thể đểkết tủa phức hệ kháng nguyên kháng thể đồng thời kéo theocác protein khác tương tác với protein nghiên cứu (khángnguyên). Các protein kết tủa cùng sẽ được tách ra đểnghiên cứu (2)Phương pháp tạo các liên kết chéo. Với phương pháp nàythì liên kết chéo giữa các protein tương tác với nhau nhờmột tác nhân(ví dụ gluceraldehite) . Sau đó phức hệ đượctách ra và phân tích khi dùng điện di hai chiều để phát hiệnkhả năng hai protein có tương tác với nhau(3)Năm 1989, Stan Field (4) lần đầu tiên giới thiệu phươngpháp sử dụng kỹ thuật di truyền để nghiên cứu tương tácprotein có tên là hệ thống lai kép (Two hybride system ).Phương pháp này có nhiều ưu việt hơn hắn các phươngpháp khác. Đặc biệt là độ chính xác và độ nhạy cao màkhông phương pháp nào có thể đạt được.Nguyên lý củaphương pháp này có thể được mô tả như sau. Việc hoạtđộng của promotor cho gen “báo cáo” (reporter genes) phụthuộc vào hai nhân tố phiên mã: nhân tố hoạt hoá promotorAD (Activation Domain) và nhân tố bám vào sợi ADN đểcho ARN polymeraza bắt đầu quá trình phiên mã BD(DNA Binding Domain). Như vậy khi có mặt cả hai nhântố AD và BD thì quá trình phiên mã và dịch mã của gen‘báo cáo” xảy ra, còn khi chỉ có một trong hai nhân tố trênthì sản phẩm của gen ‘báo cáo” không được tổng hợp.Người ta tách gen mã hoá cho hai nhân tố và gắn vào haivectơ tách dòng riêng rẽ. Muốn nghiên cứu tương tácprotein X và Y người ta tiến hành tách dòng gen mã hoácho hai protein này và lần lượt gắn vào hai vectơ AD vàBD. Sau đó hai vectơ cùng được biến nạp vào dòng tế bàobiểu hiện gen. Kết quả là tạo ra các protein lai ( fussionprotein) AD-X và BD-Y. Nếu hai protein X và Y có tươngtác với nhau thì cả AD và BD cùng hoạt hoá promotor vàsản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện. Ngược lại ,nếu hai protein X và Y không tương tác với nhau thì tácđộng của chúng đối với promotor là riêng rẽ do đó khôngcó sản phẩm của gen “báo cáo”. Hình 1: Cơ sở phân tử của hệ thống lai kép Phức hệ phiên mã gồm AD và BDa. Sử dụng phức hệ phiên mã để nghiên cứu tương tácb.hai protein X và YPhương pháp lai kép được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứutương tác protein trong một số trường hợp sau: Nghiên cứu tương tác hai protein như đã mô tả ở trên.1. Nghiên cứu tương tác giữa các đoạn peptit chức năng2.(domain) khác nhau của một protein với các protein khác. Nghiên cứu sàng lọc (screening) từ thư viện gen để3.tìm kiếm các protein tương tác với một protein đã biết.Dưới đây chúng tôi sẽ trình bày một thí nghiệm ứng dụngkỹ thuật hệ thống lai kép với tế bào chủ là nấm men đểnghiên cứu các protein tương tác vớ photphataza (TTP30).II. SỬ DỤNG HỆ THỐNG LAI KÉP NGHIÊN CỨUCÁC PROTEIN TƯƠNG TÁC VỚI MỘTPHOTPHATAZA TTP30.A.Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu:Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis, Viện CNSHthực vật, ĐHTH Munich. Đức.Plasmit pGBT9 mang Gal4-BD và Trp và PlasmitpGAD424 mang Gal4-AD và Leu.Dòng tế bào nấm men HF7C khuyết dưỡng Leu.,Trp.,vàHis.,thư viện gen ( cDNA library) của Arabidopsis đã đượcgắn vào plapsmit pGAD424 mang gen Leu.( Công tyclontech ,USA) cung cấp.2. Hoá chất dùng cho nghiên cứu:Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và gắnvào vectơ pGBT9 như sau:F1,R1;F2R2 và F3.Các hoá chất khác dùng cho nghiên cứu đạt độ tinh khiếtcho sinh học phân tử từ các nhà sản xuất Meck, Sigma.Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn dịch phản ứng 25 microlit:dNTP: 0,25 microMol., đệm tris : pH:8.0 10 mM,MgCl2:1mM, DNA mồi (primer) 50ng, DNA khuôn(template) 10-20ng) ,94 oC:45s,55 oC:45s,72oC :45s. Số chu kỳ lặp lại : 35. Kỹ thuật: Sử dụng cá kỹ thuậ ...