BÁO CÁO KHOA HỌC: SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN (PCRRFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ THỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNG HEMOPHILIA

9 bà mẹ của 9 bệnh nhân nam mắc bệnh Hemophilia A (trong đó có trường hợp một mẹ và hai con trai mang bệnh) được phân tích tính đa hình ADN của vùng Intron 18 trên gen mã cho yếu tố VIII bằng enzym giới hạn Bcl I. Kết quả phân tích cho thấy 4/9 bà mẹ (44.44%) mang cặp alen dị hợp tử XhX về bệnh máu khó đông và truyền bệnh cho con trai mình tạo thành dạng XhY gây bệnh.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN (PCRRFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ THỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNG HEMOPHILIA"SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN (PCR-RFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁTHỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNGHEMOPHILIA ALê Nhật Minh1, Lê Thị Kim Tuyến1, Võ Thị ThươngLan2, Đỗ Trung Phấn31 Phòng sinh học phân tử, Viện Vệ sinh dịch tễ TW.2 Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.3 Viện Huyết học và truyền máu TWTóm tắt: 9 bà mẹ của 9 bệnh nhân nam mắc bệnhHemophilia A (trong đó có trường hợp một mẹ và hai contrai mang bệnh) được phân tích tính đa hình ADN của vùngIntron 18 trên gen mã cho yếu tố VIII bằng enzym giới hạnBcl I. Kết quả phân tích cho thấy 4/9 bà mẹ (44.44%) mangcặp alen dị hợp tử XhX về bệnh máu khó đông và truyềnbệnh cho con trai mình tạo thành dạng XhY gây bệnh.MỞ ĐẦUBệnh ưa chẩy máu hay còn gọi là Hemophilia là một bệnhdi truyền gen lặn, liên kết nhiễm sắc thể giới tính X thườnggặp ở nước ta. Bệnh Hemophilia là do thiếu các yếu tốđông máu tham gia vào quá trình đông máu như yếu tố VIII- hemophilia A hoặc yếu tố IX - hemophilia B [1,2]. Tỉ lệmắc bệnh ở các nước khác nhau, trung bình 1/10.000 dân.Nước ta, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máuTW có khoảng 5000 bệnh nhân Hemophilia. Trong số bệnhnhân mắc bệnh máu khó đông thì bệnh Hemophilia A làphổ biến hơn cả, chiếm khoảng 85%.Trên thế giới cácnghiên cứu sinh học phân tử đã chứng minh Hemophilia Acó liên quan với một số đột biến nhất định trên gen mã hoátổng hợp yếu tố VIII. Trong đó, đột biến ở vùng intron 18liên quan với sự mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn BclI là phổ biến nhất. Đề tài này, nghiên cứu mối liên quan củabệnh Hemophilia A ở Việt nam với đột biến này. Trên cơsở đó có thể xác định được những bà mẹ mang gen dị hợptử XhX và chẩn đoán sớm, có thể là ngay từ giai đoạn bắtđầu mang thai, để có những biện pháp xử lý thích ứng vớimỗi trường hợp.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng: Năm ml máu được lấy từ 9 bà mẹ và 91.bệnh nhân nam (con trai của các bà mẹ đó). Máu đượcchống đông bằng EDTA 10mM.2. Phương pháp:a. ADN được tách từ máu theo phương pháp sử dụng nồngđộ muối cao. [ ]b. Phản ứng PCR: một ống 50l gồm có: 5l ADN khuôn;5l dNTPs 10mM; 1,5mM MgCl2; 0,5 U Taq; 0,8 nM mỗiloại mồi; 5l đệm PCR. 50l mỗi ống được làm phản ứngPCR trên máy Amp Gen 9700 với chương trình 94oC- 7’;30 chu kỳ: 94oC - 1’; 58oC-1’’; 72oC -1’; 72oC 10 phút;40C-20’. 40nM ADN mồi với trình tự của đôi mồi là:8.1: 5’ TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC 3’8.2: 5’ TTCGAATTCTGAAATTATCTTGTTC 3’c. Cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn: 1l BclI; 3lđệm enzym NBE3 (New England Biolab) và 25l sảnphẩm PCRd. Chạy điện di: sản phẩm PCR trước và sau khi cắt vớiBclI được chạy điện di trên gel Polyacryamid 10%, 100Vtrong 1h.e. Phát hiện các băng ADN bằng phương pháp nhuộm bạc.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1. Kết quả PCR của các mẫu bệnh phẩm.ADN tách từ các bệnh nhân Hemophilia A và các bà mẹđược dùng trong phản ứng PCR. Hình 1: Kết quả PCR của các mẫu bệnh phẩm M1: Thang ADN x 174HaeIII; M2: ADN pBR322 MspI; 1-7: Sản phẩm PCR của bệnh nhân Hemophilia A; 8 chứng dương người bình thường.Kết quả điện di trên Hình 1 cho thấy những mẫu bệnhphẩm cho sản phẩm PCR là đoạn ADN trên intron 18 có độdài 142 bp.2. Kết quả phân tích RFLP của intron 18 bằng emzymgiới hạn BclIĐoạn ADN dài 142 bp thuộc vùng intron 18 trên nhiễm sắcthể X bình thường (không có đột biến) có một vị trí nhậnbiết của enzym giới hạn BclI tại nucleotit thứ 99. Do đó nósẽ bị cắt thành hai đoạn ADN có chiều dài tương ứng là 99bp và 43 bp. Vạch ADN nhỏ 43bp thể hiện mờ hơn trên gelvì độ phát sáng của phương pháp nhuộm bạc tương đươngvới trọng lượng phân tử ADN. Sự có mặt rõ ràng của vạch99bp đủ để xác định không có đột biến. Khi xảy ra đột biếnđiểm làm thay đổi trình tự tại vị trí nhận biết của BclI, đoạnADN không bị cắt và giữ nguyên chiều dài 142 bp. Nhưvậy tính đa hình độ dài các đoạn ADN cắt với enzym giớihạn BclI (PCR-RFLP) gồm các đoạn ADN có kích thước142 bp; 99 bp và 43 bp. Trên cơ sở đó có thể phân tích kếtquả xét nghiệm của một số cặp mẹ con (Hình 2) Hình 2: Kết quả điện di và phân tích RFLP. M1: ADNchuẩn X174 HaeIII; M2: ADN chuẩn pBR 322 MspI. 1-2: cặp mẹ con thứ 1; 3-4: cặp mẹ con thứ 2; 5-6: cặp mẹ con thứ 3; 7-8: cặp mẹ con thứ 4 Ở cặp mẹ con thứ nhất (1: người con trai; 2: người1.mẹ) và thứ tư (7: người con trai; 8: người mẹ) cho thấy tínhđa hình độ dài các đoạn giới hạn với enzym Bcl I (PCR-RFLP) ở người mẹ thể hiện ba đoạn ADN có kích thước142bp, 99bp và 43bp. Theo kết quả RFLP của hai người mẹnày thì đột biến xảy ra trên một nhiễm sắc thể giới tính Xtại vùng không mã hoá intron 18, thuộc đoạn ADN dài142bp được nhân lên bằng phản ứng PCR. Đột biến nàytương ứng với sự thay đổi nucleotit làm mất vị trí nhận biếtcủa enzym giới hạ ...