BÁO CÁO KHOA HỌC: TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 16S ARNR CỦA VI KHUẨN LAM ANABAENA AZOTICA

Vi khuẩn lam là sinh vật quang dưỡng, có khả năng sử dụng ánh sáng để đồng hoá cacbon và cố định nitơ phân tử từ khí quyển giúp cải tạo đất trồng trọt (2). Một số loài vi khuẩn lam còn có thể được sử dụng làm thức ăn, làm thuốc và chế tạo mỹ phẩm (8).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 16S ARNR CỦA VI KHUẨN LAM ANABAENA AZOTICA"TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 16SARNR CỦA VI KHUẨN LAM ANABAENAAZOTICALê Quang Huấn, Hoàng Phương Hà, Trần Văn NhịViện Công nghệ Sinh học1. GIỚI THIỆU CHUNGVi khuẩn lam là sinh vật quang dưỡng, có khả năng sửdụng ánh sáng để đồng hoá cacbon và cố định nitơ phân tửtừ khí quyển giúp cải tạo đất trồng trọt (2). Một số loài vikhuẩn lam còn có thể được sử dụng làm thức ăn, làm thuốcvà chế tạo mỹ phẩm (8). Những nghiên cứu gần đây chothấy vi khuẩn lam là một nguồn nguyên liệu phong phú vềcác chất có hoạt tính sinh học: các peptid, alcaloid,phicobilinprotein với các hoạt tính kháng khuẩn, khángnấm, kháng u...(4, 5). Nhiều loại vi khuẩn lam đã đượcnghiên cứu để sử dụng làm phân đạm vi sinh ở ấn Độ,Trung Quốc và ở Việt Nam (2, 9) . Chính vì vậy, vi khuẩnlam ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu rộng rãi củanhiều phòng thí nghiệm trên thế giới.Trong các nghiên cứu, việc phân loại có ý nghĩa rất quantrọng làm nền tảng cho những nghiên cứu tiếp theo.Phương pháp phân loại truyền thống dựa vào đặc điểm hìnhthái và các đặc điểm sinh hoá do Stanier năm1977 (7) vàRippka năm 1979 (6) đề xướng đã đóng vai trò rất quantrọng. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp hiện tượngthường biến gây nên những nhầm lẫn trong phân loại.Những hạn chế này chỉ có thể được giải quyết khi sử dụngphương pháp phân loại phân tử, dựa vào việc phân tíchtrình tự gen 16S ARNr. Trình tự nucleotit của gen này hầunhư không có sự trao đổi giữa các loài (3), do vậy trình tự16S ARNr có ý nghĩa đặc trưng cho loài.Trong công trình này chúng tôi trình bầy những kết quảphân loại chủng vi khuẩn lam Anabaena azotica dựa vàotrình tự đoạn gen 16S ARNr.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệu Chủng vi khuẩn lam Anabaena azotica sử dụng trong•nghiên cứu này được lấy từ tập đoàn vi khuẩn lam củaPhòng Quang Sinh, Viện Công nghệ Sinh học. Vectơ táchdòng được sử dụng là Vectơ pCR 2.1 (Invitrogen). Các hoá chất sử dụng trong thí nghiệm đều là những•hoá chất tinh khiết được sử dụng trong các phòng thínghiệm về sinh học phân tử (hoá chất của các hãng Sigma,Invitrogen, Merck...).Phương pháp Phương pháp tách ADN tổng số của vi khuẩn, ADN•plasmit được tiến hành theo phương pháp của Knut Rudi vàcs (1). Phương pháp nhân bản đoạn gen 16S ARNr của chủng•Anabaena azotica được tiến hành với cặp mồi:NostF:5-gcttaacacatgcaagtcgaacgg-3 vàNostR:5-cagcctgcgatctgactgagc-3 Phản ứng nhân bản (PCR) có chu trình nhiệt như sau:•3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Tách chiết ADN tổng số vi khuẩn lamADN tổng số của vi khuẩn lam Anabaena azotica đượctách theo phương pháp của Knut Rudi và cs (1). Kết quảtách chiết ADN tổng số được kiểm tra trên gel agarose0,8% và được trình bày trên hình 1.Qua ảnh chụp kết quả điện di (máy chụp ảnh điện di (GEL-DOC) cho thấy ADN tách chiết theo phương pháp màchúng tôi đã trình bày (phần phương pháp) có độ tinh sạchcao (băng ADN khá rõ) có thể sử dụng cho các nghiên cứutiếp theo. Hình 1: Kết quả điện di mẫu ADN tách từ vi khuẩn lam trên gel agaroza 0,8%Kênh 1: Mẫu ADN tách từ chủng vi khuẩn lam AnabaenaazoticaKênh 2: Mẫu ADN tách từ chủng vi khuẩn lam số 6 (chưaxác định tên)3.2. Nhân bản đoạn gen 16S ARNrĐể phân lập và tách đoạn gen 16S ARNr vi khuẩn lamchúng tôi đã thiết kết cặp mồi NOSTF/NOSTR (xem phầnphương pháp) dựa vào trình tự gen 16S ARNr của cácchủng vi khuẩn lam đã được công bố trong ngân hàng dữliệu gen Quốc tế.Thành phần phản ứng PCR ngoài các thành phần cơ bảnnhư ADN khuôn, cặp mồi NOSTF/NOSTR, Taq ADN-polymeraza, dNTP còn có muối MgCl2 (Phần phươngpháp). Vì sử dụng ADN tổng số làm khuôn, cho nên để tạođiều kiện thuận lợi cho việc duỗi xoắn chuỗi ADN kép vàkhông làm mất hoạt tính của enzym Taq ADN-polymeraza,chúng tôi tiến hành biến tính ADN trước khi bổ sungenzym Taq ADN-polymeraza. Quy trình biến tính đượctiến hành như sau: Bổ sung đầy đủ các thành phần cần thiếtcho phản ứng PCR (ngoại trừ Taq ADN-polymeraza), ốngphản ứng được để trên bể nhiệt 94 0C thời gian 4 phút, sauđó bổ sung Taq polymeraza và phản ứng PCR được tiếnhành theo chu kỳ nhiệt như sau:(94oC 50 giây, 52oC 50 giây, 72oC 1 phút 30 giây ) /30 chukỳ; 72oC 8 phútSản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza1 %. Kết quả được trình bầy trên hình 2. Hình 2: Điện di kiểm tra sản phẩm PCRKênh 1: Sản phẩm PCR chủng Anabaena azoticaKênh 2: Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn lam số 6 (chưa xácđịnh tên)Kênh 3: Chỉ thị phân tử ADNQua kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gelagaroza 1%, ta thấy một băng ADN rất rõ nét có kích thướckhoảng trên 1000bp.3.3. Tách dòng sản phẩm PCRĐể tách dòng và xác định trình tự đoạn gen nhận được sauphản ứng PCR, chúng tôi sử dụng vectơ pCR2.1(Invitrogen). Sản phẩm PCR không cần phải qua một bướctinh chế nào mà được sử dụng ...