BÁO CÁO KHOA HỌC: TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP19 CỦA VI RÚT WSSV GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)

Ngành công nghiệp thủy hải sản nói chung, ngành công nghiệp nuôi tôm nói riêng phát triển mạnh mẽ trên khắp thế giới đã mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho nhiều quốc gia trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, sự gia tăng trong hoạt động nuôi trồng lại dẫn tới sự bùng nổ các bệnh gây ra bởi vi khuẩn và vi rút.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP19 CỦA VI RÚT WSSV GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)"TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓAPROTEIN VỎ VP19 CỦA VI RÚT WSSV GÂY HỘICHỨNG ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (PENAEUSMONODON)Nguyễn Quỳnh Anh (1), Nguyễn Đức Hoàng (2), TrầnLinh Thước (1,2)(1) Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học,TrườngĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM(2) Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử,TrườngĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCMMỞ ĐẦUNgành công nghiệp thủy hải sản nói chung, ngành côngnghiệp nuôi tôm nói riêng phát triển mạnh mẽ trên khắp thếgiới đã mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho nhiều quốcgia trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, sự gia tăng trong hoạtđộng nuôi trồng lại dẫn tới sự bùng nổ các bệnh gây ra bởivi khuẩn và vi rút. Dù xuất hiện muộn nhưng hội chứngđốm trắng đã nhanh chóng lan rộng khắp nơi với nhữngthiệt hại ước tính khoảng 1 tỉ USD mỗi năm trên phạm vitoàn thế giới. Trước tình hình đó, việc phát hiện bệnh sớmđể có các biện pháp xử lý thích hợp đã trở nên ngày càngcấp thiết [1].Các phương pháp được dùng để phát hiện bệnh là mô học,phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), phươngpháp lai và phương pháp miễn dịch [1]. Với thế mạnh là cóthể dùng để phát hiện bệnh ngoài phòng thí nghiệm,phương pháp miễn dịch có thể được các hộ nuôi trồng sửdụng trực tiếp tại nơi sản xuất để phát hiện bệnh nhanh ởtôm nuôi mà không cần phải gửi mẫu tới các phòng thínghiệm. Do đó, có thể nhanh chóng có những biện pháp đốiphó thích hợp, giảm thiểu được các tổn thất.Trong phương pháp miễn dịch phát hiện bệnh, kháng thểđược sử dụng để phát hiện nhanh kháng nguyên có nguồngốc từ bệnh (như bản thân vi rút, một loại protein vỏ nào đócủa vi rút). Nhiệm vụ của các nhà khoa học là phải tìmđược đúng loại kháng thể thích hợp. Hiện nay, có một điềubất lợi là chưa nuôi được tế bào tôm để nhân vi rút dùnglàm kháng nguyên để tạo kháng thể, do đó phương phápkhả thi hơn là ứng dụng các kỹ thuật di truyền để thu nhậnprotein vỏ của vi rút làm kháng nguyên để tạo kháng thể.Các nghiên cứu trước đây cho biết vi rút WSSV gây hộichứng đốm trắng không chỉ ở tôm mà còn trên nhiều loàigiáp xác khác. Vi rút này có kích thước khá lớn với ADNbộ gen vòng, mạch đôi kích thước khoảng gần 300kb [2, 3].Virion WSSV có 5 protein cấu trúc chính, được gọi têntheo trọng lượng phân tử khi điện di SDS-PAGE, trong đócó 2 loại protein hiện diện tại vỏ của vi rút là VP19(19kDa) và VP28 (28kDa) [4, 5, 6, 7].Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi tiến hành tạo dòng vàbiểu hiện gen mã hóa cho protein vỏ VP19 của vi rútWSSV (White Spot Syndrome Virus) trong Escherichiacoli để phục vụ mục tiêu tạo kháng thể sử dụng trongphương pháp miễn dịch phát hiện nhanh WSSV.VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁPChủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 [F-endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi l- recA1 gyrA96 DlacU169 (f80 lacZ DM15)] được sử dụng để tạo dòng cácplasmid mang đoạn gen VP19; Escherichia coli HB101[sup E44 hsdS20 (rB-/mB-) recA13 ara14 proA2 lacY1gaIK2 rpsL20 xyl5 mH1] được dùng làm tế bào chủ để biểuhiện gen mã hóa protein VP19 bằng vector biểu hiện pEZZ18 (Genbank M74186) [8]. E. coli được nuôi cấy trong môitrường Luria-Bertani (LB) [1% tryptone, 0,5% yeast extractvà 1% NaCl] có bổ sung 100g/ml ampicillin (khi cần) đểlàm nhân tố chọn lọc.Nguồn ADN. Mẫu tôm bệnh có nguồn gốc từ Sóc Trăng.Tách chiết ADN từ mẫu tôm và kiểm bằng PCR nhờ bộ kitphát hiện vi rút gây bệnh đốm trắng của Phòng thí nghiệmCông nghệ sinh học phân tử, Trường ĐH Khoa học tựnhiên, Đại học quốc gia TP. HCM. Mẫu ADN dương tínhđược sử dụng làm ADN khuôn để nhân bản và thu nhậnđoạn gen VP19 bằng phản ứng PCR.Thiết kế plasmid. Với mục đích biểu hiện protein vỏ VP19của vi rút WSSV dưới dạng protein dung hợp Protein A-VP19, plasmid pZ-VP19 được thiết kế như sau. Đoạn genVP19 được khuếch đại và thu nhận bằng phản ứng PCR sửdụng ADN bản mẫu được tách chiết từ mẫu tôm bệnh vàcặp mồi VP19-2f, 5’ -ACAGGGATCCAATGGCCACC-ACG-3 để tạo vị trí cắt BamHI và VP19-2r, 5’ -TTCTAAGCTTTTACT-GCCTCCTCTTGG-3 để tạo vị trícắt HindIII. Thành phần phản ứng PCR gồm nước cất, đệm10X, dNTP 10X (2mM mỗi loại), ADN bản mẫu (50ng/l),mồi xuôi và mồi ngược (10pmole/l), Pfu ADNpolymerase (3U/l). Tinh chế sản phẩm PCR thu được vàcắt bằng BamHI và HindIII. Đoạn gen VP19BamHI/HindIII được nối vào plasmid pEZZ 18 tại BamHIvà HindIII nhờ T4 ADN ligase. Thành phần phản ứng nốigồm plasmid pEZZ 18, đoạn gen VP19, PEG 6000 30%,đệm 10X và enzym nối T4 ADN ligase. Sản phẩm nối sauđó được biến nạp vào E. coli DH5.Các phương pháp tuyển chọn và kiểm tra dòng mang genmục tiêu. Sản phẩm nối sau khi được biến nạp vào E. coliDH5 sẽ được chọn lọc sơ bộ dựa trên kiểu hình khángampicillin và màu sắc xanh trắng của khuẩn lạc. Các khuẩnlạc dự tuyển được kiểm chứng bằng phương pháp PCRkhuẩn lạc sử dụng cặp mồi của gen VP19-2f/VP19-2r.Phương pháp bản đồ cắt hạn chế cũng được sử dụng đểkiểm tra plasmid thu được [9]. Sau khi được tạo dòng, genVP19 được giải trình tự trên máy giải trình tự ALF expressII, Amersham Biosciences và phân tích, so sánh kết quảbằng chương trình Jellyfish (Biowife).Điện di phân tích protein bằng phương pháp SDS - PAGE.Plasmid pZ-VP19 được tách chiết từ E. coli DH5 bằngphương pháp SDS - kiềm, đo nồng độ và độ tinh sạch bằngquang phổ kế. Biến nạp pZ-VP19 vào E. coli HB101, nuôicấy trong môi trường LB lỏng chứa 100g/ml ampicillinđến khi đạt tới pha ổn định. Protein dung hợp được tổnghợp và tiết ra ngoài môi trường nhờ trình tự tín hiệu tiết cótrên pZ-VP19 [8]. Tủa protein bằng muối amonium sulfatbão hòa và điện di phân tích protein trên gel polyacrylamidvới sự hiện diện của Sodium Dodecyl Sulfate[9] cùng vớithang chuẩn protein và mẫu đối chứng là protein thu từ môitrường nuôi cấy E. coli HB101 chứa plasmid pEZZ 18không có đoạn chèn để xác định sự hiện diện của proteindung hợp Protein A ...