BÁO CÁO KHOA HỌC: TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B (HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN

Viêm gan do virus viêm gan B (HBV) hiện đang được xem là một căn bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất trên thế giới. Trên cơ sở điều tra rộng rãi về kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (HBsAg) và kháng thể kháng kháng nguyên này (anti-HBsAg) người ta đã có thể nhận định HBV đã và đang lưu hành trên toàn thế giới.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GEN KHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B (HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN"TẠO DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN GENKHÁNG NGUYÊN LÕI CỦA VIRUT VIÊM GAN B(HBcAg) PHÂN LẬP TỪ KHỐI U CỦA BỆNH NHÂNUNG THƯ GANĐặng Trường Minh, Lê Thị Tâm, Bạch Như Quỳnh,Đồng Văn Quyền, Đinh Duy KhángViện Công nghệ sinh họcI. MỞ ĐẦUViêm gan do virus viêm gan B (HBV) hiện đang được xemlà một căn bệnh nguy hiểm và phổ biến nhất trên thế giới.Trên cơ sở điều tra rộng rãi về kháng nguyên bề mặt củavirus viêm gan B (HBsAg) và kháng thể kháng khángnguyên này (anti-HBsAg) người ta đã có thể nhận địnhHBV đã và đang lưu hành trên toàn thế giới. Bệnh nàythường để lại hậu quả nghiêm trọng là xơ gan và ung thưgan với tỷ lệ tử vong cao. Do vậy viêm gan B hiện là mộtvấn đề đang được chú trọng trong chương trình bảo vệ sứckhoẻ cộng đồng toàn cầu [1].Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện naycó khoảng 400 triệu người bị nhiễm HBV trên toàn cầu,như vậy HBV có thể được xem như một trong những mầmbệnh phổ biến nhất đối với con người. Số người chết liênquan trực tiếp đến nhiễm HBV hàng năm lên tới khoảng 2triệu người. Ở Việt Nam, theo báo cáo của bộ Y tế từ năm1978 đến năm 1990, số mắc viêm gan B khoảng 20.000người/năm và tỷ lệ tử vong là 0,7% - 0,8%. Hiện tại, Việtnam vẫn đang được xếp vào một trong những quốc gia cótỷ lệ người nhiễm HBV cao nhất trên thế giới [3]. Điềuquan trọng là cho đến nay chưa có một hoá trị liệu nào đặchiệu để điều trị viêm gan B. Phương pháp duy nhất để tránhviêm gan B là dự phòng bằng vắc xin. Vì vậy có thể coi dựphòng viêm gan B cũng là một biện pháp hữu hiệu để dựphòng ung thư gan nguyên phát. Trước tình hình lây nhiễmcủa HBV như hiện nay, thì việc đẩy mạnh sản xuất vắc xintrong nước bằng việc nhập khẩu một dây chuyền công nghệhiện đại kết hợp với việc nghiên cứu tách dòng và biểu hiệngen từ đối tượng gây bệnh phân lập trong nước là cần thiết.Chúng tôi đã nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểuhiện gen mã hoá kháng nguyên bề mặt của virus viêm ganB với mục đích sản xuất được loại kháng nguyên này để tạora bộ sinh phẩm chẩn đoán viêm gan B cũng như phát triểnvắc xin tái tổ hợp [4, 5, 7]. Tuy nhiên, để có thể đánh giámột cách chính xác về mặt dịch tễ học của virus viêm ganB thì việc phối hợp giữa phát hiện HBsAg, kháng thểkháng HBsAg và kháng thể kháng HBcAg là cần thiết.Kháng thể kháng HBcAg hình thành sớm và tồn tại gầnnhư suốt cả cuộc đời người đã bị nhiễm HBV, vì vậy khócó thể bỏ sót các trường hợp hợp nhiễm HBV nếu phát hiệnkháng thể loại này.Xuất phát từ mục tiêu trên, chúng tôi đã tiến hành táchdòng và thiết kế vectơ để biểu hiện gen mã hóa khángnguyên lõi của virus viêm gan B (gen hbc) từ khối u củabệnh nhân ung thư gan nhằm thu nhận kháng nguyên lõi táitổ hợp để phục vụ công tác chẩn đoán.II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPThiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR: Cặp mồi dùng chophản ứng PCR được thiết kế nhờ chương trình phần mềmPC/Gene dựa trên trình tự của đoạn ADN thuộc genôm củavirus viêm gan B chứa gen hbc đã được công bố trongNgân hàng dữ liệu gen quốc tế [2]. Vị trí bám của mồi vàovùng chứa gen hbc được nêu ở hình 1. Hình 1: Vị trí của cặp mồi HBCP1, HBCM1 trong mộtvùng ADN genôm của virus viêm gan B, chứa toàn bộ gen kháng nguyên lõi của virus viêm gan B với chiều dài 552 cặp bazơ (phần in đậm). Theo lý thuyết, cặp mồi HBCP1, HBCM1 tạo ra sản phẩm PCR với chiều dài là 619 cặp bazơ.Kỹ thuật PCR: Kỹ thuật PCR được tiến hành với 100 ngADN tách từ khối u làm sợi khuôn và cặp mồi đặc hiệuHBCP1 và HBCM1, có trình tự như sau:HBCP: 5-TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGC-3HBCM1:5-TCCCACCTTATGAGTCCAAGGG-3Sử dụng 1 đơn vị Taq Polymeraza của công ty PerkinElmer cho mỗi ống phản ứng. PCR được tiến hành nhờmáy chu kỳ nhiệt MJ PTC-100 (Mỹ) với chương trình nhưsau: Biến tính ADN trong 3 phút rồi chạy 30 chu kỳ (95 0C50 giây, 550C 50 giây, 72 0C 1 phút 25 giây). Sau khi kếtthúc chu kỳ, giữ ở nhiệt độ 720C 8 phút sau đó giữ ở 40C.Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza1%.Tách dòng gen được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sảnphẩm PCR vào vectơ tách dòng pCRTM với bộ Kit củahãng Invitrogen. Gen hbc tái tổ hợp với vectơ tách dòngtrước hết được kiểm tra bằng cắt với enzym giới hạn EcoRI, sau đó được giải trình tự với máy xác định trình tự ADNtự động (ALFExpress) với bộ Kit của hãng Amersham-Pharmacia Biotech.Sau khi giải trình tự, gen được dịch mã sang protein và sosánh với trình tự axit amin kháng nguyên HBcAg của cáctác giả khác bằng chương trình phần mềm PC/gene.Vectơ pMAL-c2 được sử dụng để thiết kế vectơ biểu hiệngen hbc ở E. coli. Cặp mồi treo hai vị trí giới hạn EcoR I vàHind III có trình tự:HBcR1: GGAATTCATGGACATTGACCC EcoR IHBcH3: AAGCTTCTAACATTGAGATTCC Hind IIITiến hành PCR với cặp mồi HBCR1 và HBCH3, sau đógắn sản phẩm ...