BÁO CÁO KHOA HỌC: THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN PEPTID TỔNG HỢP

Peptid là các phân tử được cấu tạo từ các phân tử nhỏ hơn gọi là các axit amin bằng liên kết peptid giữa các axit amin. So với phân tử protein các peptid có những khác biệt nhất định: (a) Protein chỉ được cấu tạo từ 20 axit amin khac nhau, trong khi đó peptid được cấu tạo từ 20 axit amin này của protein và các axit amin khác có thể có trong tự nhiên.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN PEPTID TỔNG HỢP"THIẾT KẾ VECTƠ BIỂU HIỆN PEPTID TỔNG HỢPVũ Thị Bích Hường, Lã Thị Huyền, Lê Trần Bình, LêQuang HuấnViện Công nghệ sinh họcPeptid là các phân tử được cấu tạo từ các phân tử nhỏ hơngọi là các axit amin bằng liên kết peptid giữa các axit amin.So với phân tử protein các peptid có những khác biệt nhấtđịnh: (a) Protein chỉ được cấu tạo từ 20 axit amin khacnhau, trong khi đó peptid được cấu tạo từ 20 axit amin nàycủa protein và các axit amin khác có thể có trong tự nhiên.(b) Protein có các chuỗi axit amin dài hơn peptid, do sựkhác nhau này mà protein và peptid có sự khác nhau về cácdạng cấu trúc không gian và các chức năng sinh học [ 4, 5]. Một số peptid có thẻ tuân theo cấu trúc không gian bachiều (cấu trúc bậc 2) như protein có cấu trúc đặc trưng bởi2 dạng chính: dạng xoắn alpha và dạng nếp gấp beta; Mộtsố peptid khác không tuân theo một dạng cấu trúc bền vữngđặc biệt nào mà chỉ cuộn lại một cách ngẫu nhiên, hoăc ởdạng vô định hình trong dịch tê bào, chúng chỉ thể hiện rõcấu trúc của mình khi đã tiếp cận và liên kết với màng tếbào đích. Thông thường các peptid là những tác nhân điềuhoà hoạt tính của các phân tử khác (chẳng hạn các phân tửprotein). Sự điều hoà này thông qua mối tương tác củapeptid với các phân tử chịu sự điều hoà. Như vậy có cácpeptít với hoạt tính hoocmon, các peptid khác với hoạt tínhkháng khuẩn... Một số peptid được cơ thể tổng hợp trựctiếp, một số khác là sản phẩm thuỷ phân của các phân tửprotein. Vì vậy, peptid này có hoạt tính sinh học xác định,peptid kia chỉ là sản phẩm trung gian của quá trình thuỷphân tới các sản phẩm cuối cùng [2, 6].Để góp phần hiểu rõ về vai trò của các peptid trong cơ thểsống cũng như tác dụng của các peptid trong y học chúngtôi trình bầy những kết quả nghiên cứu thiết kế vectơ đểbiểu hiện peptid được tổng hợp theo phương pháp hoá học.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệu, hoá chấtDựa vào tính chất đặc trưng của các axit amin và trình tựxắp xếp của chúng trong các phân tử peptid có hoạt tínhkháng khuẩn, kháng virus đã được xác định chúng tôi tổnghợp đoạn gen mã hoá cho một peptid theo phương pháphoá học có trình tự như sau:Chủng vi sinh vật E.coli BL21; Vectơ biểu hiện pMAL-c2;Các hoá chất sử dụng trong thí nghiệm: IPTG (isopopyl -D- Thiogalactopyranoside) (Sigma), SephadexG-75,sephadex G-25 (Sigma), Cột sắc ký ái lực amylose resincủa hãng New England Biolab, Maltose (Sigma), Factor-Xavà các hoá chất sử dụng khác đều là những hoá chất tinhkhiết. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: môi trường lỏng LB( 2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl); môi trườngchọn lọc là môi trường LB bổ sung ampicillin nồng độ100g/ml.Phương pháp1.Thiết kế vectơ biểu hiện gen tổng hợpNhư đã trình bầy ở phần trên đoạn gen được tổng hợp dướidạng hai chuỗi đơn nucleotid, sau khi chúng kết hợp vớinhau theo nguyên tắc bổ trợ theo chu trình nhiệt mà chúngtôi đã trình bầy trong thông báo trước đây [1], cụ thể: trộnhai dung dịch chúa cùng nồng độ các chuỗi nucleotid đãtổng hợp, biến tính 950C trong khoảng thời gian là 5 phút,sau đó để lạnh từ từ tới nhiệt độ phòng. Đoạn ADN tạothành sau phản ứng là một sợi kép với hai dầu dính có trìnhtự các nucleotid đặc trưng cho trình tự đoạn ADN đã đượccắt bởi các các enzym hạn chế EcoR I và Hind III. ĐoạnADN này sẽ được gắn vào vectơ biểu hiện pMAL-C2 saukhi đã được cắt bỏ vùng cắt gắn đa vị từ vị trí nhận biết củaenzym hạn chế EcoR I tới vị trí nhận biết của enzym hạnchế Hind III (hình 1). Hình 1: Trình tự vùng cắt gắn đa vị của vectơ pMAL-c22. Tách chiết và tinh chế protein liên kếtTừ 300ml dịch nuôi cấy tế bào sau khi cảm ứng 3giờ đượcly tâm với vận tốc 5000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút,phần tế bào kết lắng được hoà lại trong 15ml dung dịchđệm (10mM Tris-HCl, pH=8,0; 1mM EDTA). Sau đó sựthuỷ giải tế bào được thực hiện bằng siêu âm hoặc enzymlysozym (100g/ml).Lấy 1ml dịch thuỷ giải tế bào đưa lên cột ái lực amyloseresin. Sau khi rửa cột với 15 ml dung dịch đệm (20mMTris-HCL, pH=8,0, 1mM EDTA, 200mM NaCl), proteinliên kết được giải hấp với dung dịch đệm trên có bổ sungmaltose (20mM Tris-HCL, pH=8,0, 1mM EDTA, 200mMNaCl, 10mM maltose). Thu 10 phân đoạn (mỗi phân đoạn1ml) ngay sau khi đưa mẫu lên cột.3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1. Thiết kế vectơ mang gen peptid tái tổ hợpGen tổng hợp sau khi được gắn vào vectơ pMAL-C2 nhờcác enzyme giới hạn EcoR I và Hind III được biến nạp vàochủng vi khuẩn tách dòng E.coli DH5 và chọn lọc trênmôi trường LB chứa ampicillin (100g/ml).Để kiểm tra kết quả biến nạp, chúng tôi đã tiến hành táchchiết ADN plasmid vectơ đã thiết kế được và nhân trong tếbào E.coli chủng DH5 mang gen peptid tổng hợp (Hình 2) Hình 2: Kết quả tách chiết ADN plasmid Kênh 1-4: ADN plasmit thu được từ các thể biến nạp Kênh 5: ADN plasmit gốc (vectơ pMAL-c2 gốc).Trên điện di đồ ta thấy các mẫu ADN plasmit thu được cóđộ tinh kh ...