BÁO CÁO KHOA HỌC: THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI (HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO

Các yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGFs (Fibroblast Growth Factor) là những polypeptide thuộc nhóm cytokine, được tiết ra ở các tế bào động vật, có hoạt tính gây phân bào mạnh. Các thành viên của nhóm FGF đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lí như quá trình sinh trưởng, biệt hóa tế bào, hình thành các mô, thành mạch máu, sửa chữa và làm lành vết thương...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI (HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTH FACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO"THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ TĂNGTRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI 10 CỦA NGƯỜI(HFGF-10 -HUMAN FIBROBLAST ROWTHFACTOR -10) Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAONguyễn Bích NhiViện Công nghệ Sinh họcMasashi SuzukiNational Istitute of Bioscience and Human Technology,Tsukuba, JapanĐẶT VẤN ĐỀCác yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGFs (FibroblastGrowth Factor) là những polypeptide thuộc nhóm cytokine,được tiết ra ở các tế bào động vật, có hoạt tính gây phânbào mạnh. Các thành viên của nhóm FGF đóng vai trò quantrọng trong nhiều quá trình sinh lí như quá trình sinhtrưởng, biệt hóa tế bào, hình thành các mô, thành mạchmáu, sửa chữa và làm lành vết thương... (Mc Keehan vàcs., 1998).Nhiều thành viên của nhóm FGF có chứa đoạn tín hiệupeptide mã hóa cho các protein tiết. FGF-10 là thành viênthứ 10, dược phát hiện ra bởi Yamasaki và cs., 1996. cDNAcủa hFGF-10 mã hóa cho một protein gồm 208 acid amin,trong đó 40 acid amin đầu (đầu N) có tính kị nước cao, làđoạn có vai trò như một tính hiệu peptide (Yamasaki và cs.,1996, Emoto và cs., 1997. Do đó FGF-10 có thể có khảnăng tiết. Nhiều thành viên của nhóm FGF như FGF-5(Bates và cs., 1991; Ozawa và cs., 1998, Clements và cs.,1993), FGF-6 (Asada và cs), FGF-7 (MacArthur và cs.,1995), FGF-9 (Santos - Ocampo và cs., 1996) ... có chứa vịtrí N-glyccosyl và một số thành viên của nhóm FGF đượctinh chế ở dạng glycosyl hóa. Để nghiên cứu, tìm hiểu cáctính chất của FGF-10 và sự biến đổi của nó liên kết với cácmạch carbohydrate , chúng tôi đã sử dụng và thiết kế vectorpcDNA3.1(-) Myc-His (Invitrogen) để biểu hiện hFGF-10ở các tế bào động vật có vú.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU1. ARN tổng số từ não người (Toyobo)2. Vector tách dòng PCR -TRAP (GenHunter)3. Vector biểu hiện pcDNA3.1(-)MycHis Version B(Invitrogen).4. Làm sạch sản phẩm PCR: sử dụng PCR QiaQuick PCRKit (Qiagen)5. Tách ADN plasmid sử dụng MiniPrep Kit (PE AppliedBiosystem)6. Xác định trình tự ADN sử dụng thiết bị ABI 310 -PRISM Genetic Analyzer (Perkin Elmer)KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU1. Thiết kế cặp mồi để biểu hiện hFGF-10 ở tế bào độngvật có vú:Dựa vào trình tự của toàn bộ đoạn gen hFGF-10 (số đăng kítrong Gen Bank là AB 002097 DDBJ), cặp mồi để nhânhFGF-10 đã được thiết kế sử dụng vector pcDNA3.1(-)Myc-His để biểu hiện ở tế bào động vật có vú với đầu 5gắn thêm vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI và đầu 3 gắnvị trí cắt của enzym HindIII. Trình tự cặp mồi như sau:2. Phản ứng RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR) :Để thu nhận cDNA (complementary DNA - ADN bổ trợ)từ ARN tổng số được tách ra từ não người và cung cấp bởihãng Toyobo, phản ứng phiên mã ngược RT (Reversetranscriptase) đã được tiến hành trong tổng thể tích 50 lvới các thành phần phản ứng bao gồm 10l đệm 5 X RT,2l mồi ngẫu nhiên -hexamer (60 ng/l), 5l DTT - dithiothreitol (0.1 M), 8l hỗn hợp dNTPs (2.5 mM), 0.5lRNasin (40 U/l), 2l enzyme phiên mã ngược -MMLVReverse transcriptase (200 U/l), 18.5l nước cất vô trùngvà 4l ARN tổng số (250 ng/l). Phản ứng được tiến hànhở 37oC trong 75 phút. Sau đó hỗn hợp phản ứng (cDNA đãđược tổng hợp) được pha loãng 10 lần bằng nước cất vàbảo quản ở -20oC.Phản ứng PCR được tiến hành tiếp theo sử dụng cDNA vừađược tổng hợp làm mẫu (template) để nhân toàn bộ đoạngen hFGF-10. Thành phần phản ứng PCR trong tổng thểtích 25l bao gồm: 11l nước cất vô trùng, 2.5l 10 X đệmPfu, 2l dNTPs (2.5mM), 8l sản phẩm của phản ứng RTđã pha loãng 10 lần, 0.5l mồi xuôi (10pmol), 0.5l mồingược (10pmol) và 0.5l Pfu polymerase (0.5U/l).Chương trình chạy PCR: các điều kiện để chạy PCR đãđược tối ưu hóa như sau: Biến tính ở 94oC trong 2 phút; 40chu trình : 94oC trong 45 giây, 55oC trong 45 giây và 72oCtrong 2 phút; lần kéo dài chuỗi cuối cùng ở 72oC trong 10phút.Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện ditrên gel agarose 1% (hình 1). Kết quả điện di trên hình 1cho thấy sản phẩm PCR là một băng đậm đặc hiệu, có kíchthước khoảng 650 bp tương đương với kích thước củahFGF-10 có cộng thêm các vị trí cắt của các enzyme giớihạn đã thiết kế. Để kiểm tra xem sản phẩm PCR nhận đượccó phải là hFGF-10 hay không, sản phẩm PCR sau khiđược tinh chế bằng Qia Quick Kit đã được cắt bằng enzymeNsiI và ScaI. Phản ứng cắt kiểm tra được tiến hành trongtổng thể tích là 10l với các thành phần như sau: 1l đệm10X NsiI (hoặc đệm NE-II đối với ScaI), 2l sản phẩmPCR, 0.8l NsiI enzyme. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37Ctrong 1 giờ. Sản phẩm thủy phân được điện di để kiểm tratrên gel agarose 1% để kiểm tra (hình 2).Hình1: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. Đườngchạy số 1: Thang ADN chuẩn bậc thang 123bp, đường chạy số 2: sản phẩm PCR; đường chạy số 3: thang ADN chuẩn /HindIII. Hình 2. Kiểm tra cắt sản phẩm PCR bằng enzyme Sca ...