BÁO CÁO KHOA HỌC: TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENS CULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX – G75

Dịch chiết bằng đệm của hạt đậu lăng (Lens culinaris, L.) lần đầu tiên được Landsteiner và Raubitchek (1907) thông báo là có hoạt động ngưng kết hồng cầu, sau này lectin của hạt đậu lăng châu Âu (LCA) đã được một số nhà khoa học tinh chế và được sử dụng trong nghiên cứu y sinh học và miễn dịch (6).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENS CULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX – G75"TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENSCULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC SEPHADEX– G75Đỗ Ngọc Liên, Phạm Tuấn AnhTrường Đại học Khoa học Tự nhiênNguyễn Văn Lợi, Đào Kim ChiTrường Đại học Dược Hà NộiĐẶT VẤN ĐỀDịch chiết bằng đệm của hạt đậu lăng (Lens culinaris, L.)lần đầu tiên được Landsteiner và Raubitchek (1907) thôngbáo là có hoạt động ngưng kết hồng cầu, sau này lectin củahạt đậu lăng châu Âu (LCA) đã được một số nhà khoa họctinh chế và được sử dụng trong nghiên cứu y sinh học vàmiễn dịch (6). Mới đây LCA tinh khiết đã được Taketa vàcộng sự sử dụng làm nguyên liệu tạo bộ sinh phẩm chẩnđoán miễn dịch dấu hiệu AFP trong ung thư biểu mô tế bàogan nhằm phân biệt với bệnh viêm gan siêu vi trùng thôngthường (7).Ở Việt Nam đậu lăng cũng đã được trồng nhập nội và sửdụng từ thời Pháp thuộc (1) nhưng chưa có tài liệu nàocông bố về khả năng khai thác nguồn tài nguyên lectin quýhiếm này dùng cho nghiên cứu sinh y học và miễn dịch.Xuất phát từ ý tưởng đó chúng tôi bước đầu thực hiện côngviệc nghiên cứu tinh chế lectin đậu lăng (LCA) và quy trìnhthử nghiệm chế tạo bộ sinh phẩm lectin dùng trong chẩnđoán y học.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPHạt đậu lăng khô được mua ở siêu thị là sản phẩm tiêudùng trong thực phẩm ở nước ta cũng như nhiêù nước trênthế giới, đã được định tên khoa học là Lens culinaris, L,(theo Tiến sĩ phân loại học Nguyễn Đăng Khôi), được bócvỏ cứng và nghiền thành bột mịn.Hồng cầu các nhóm máu được Viện huyết học truyền máuTrung ương và bệnh viện Bạch Mai cung cấp đã xác định làkhông có yếu tố vi sinh vật truyền bệnh. Việc xác định hoạttính ngưng kết hồng cầu (HAA), biểu thị cho hoạt tínhlectin được thực hiện thường quy ở phòng thí nghiệm sinhy học thuộc Trung tâm sinh học phân tử và công nghệ tếbào, ĐHQG Hà nội như đã mô tả trước đây(2,6). Cácphương pháp xác định hàm lượnh protein theo Lowry (5),kiểm tra đáng giá mức độ tinh sạch của chế phẩm lectintinh chế được thực hiện theo kỹ thuật điện di gelpolyacrylamid ( SDS-PAGE) của Laemmli như đã mô tảtrước đây (4). Việc tinh chế lectin đậu lăng đã được hoànthiện nhờ kỹ thuật sắc ký ái lực trên cột Sephadex G-75 (3).3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.3.1 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin đậu lăngSau khi chiết rút LCA từ bột hạt bằng đệm phốtphát chứaNaCl 1M, có CaCl2 và MnCl2 1mM, chúng tôi tiến hànhxác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hàm lượngprotein trong dịch chiết. Kết quả được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1 : Hàm lượng Protein và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết đậu lăngKết quả trình bày ở bảng 1 cho thấy LCA thể hiện hoạt tínhcao nhất ở nhóm máu A. Trong các thí nghiệm tiếp theochúng tôi chỉ tiến hành thử hoạt độ ngưng kết với hồng cầunhóm máu A.3.2. Tinh chế lectin đậu lănga) Dùng HCl 1M điều chỉnh pH dịch chiết về 4,5 để loạiprotein không có hoạt tính. Sau khi li tâm, điều chỉnh pH vềtrung tính bằng NaOH 1M.b) Kết tủa phân đoạn protein đậu lăng bằng (NH4)2SO475% bão hoà.Sử dụng dung dịch muối trung tính (NH4)2SO4 ở trên đã kếttủa toàn bộ protein - lectin trong dịch chiết. Điều này đượcchứng minh là HAA ở dịch nổi sau kết tủa hầu như khôngcó. Như vậy nồng độ (NH4)2SO4 75% bão hoà đựơc sửdụng là thích hợp nhất để kết tủa thuận nghịch lectin.c)Tinh sạch lectin đậu lăng qua cột sắc kí ái lực SephadexG-75 :Phần kết tủa lectin bằng (NH4)2SO4 được thu lại và hoàtrong đệm phốtphát và thẩm tích 3 lần sau đó sẽ nạp vàocột sắc ký ái lực Sephadex G75 ( kích thước 2x20 cm) đãcân bằng với đệm chứa NaCl 1M, có CaCl2 và MnCl21mM. Phản hấp phụ bằng dung dịch đệm photphat chứaNaCl 1M, bổ sung glucose 1M và EDTA 1mM. Thu phânđoạn 3 ml, tốc độ chảy 20 ml/h. Xác định hàm lượngprotein ở các phân đoạn. Dồn các phân đoạn có hàm lượngprotein cao, thẩm tích và đông khô ở – 45oC trong 8 giờ.Toàn bộ kết quả tinh chế được thể hiện trên bảng 2. Bảng 2: Tóm tắt kết quả tách chiết và tinh chế lectin đậu Lens culinarisKết quả ở bảng 2 cho thấy từ 2g (2000 mg) bột hạt đậu lăng(Lens culinaris L.), qua quá trình tách và tinh chế chúng tôithu được 0.42 mg LCA tinh khiết, hiệu suất thu hồi hoạt độ5% và độ sạch tăng lên 57.69 lần. Mặc dù LCA đã đượctinh chế có độ sạch tăng lên rất cao nhưng khả năng thu hồilectin còn thấp. Do đó đây là một vấn đề đặt ra cho chúngtôi là cần phải tiếp tục nghiên cứu để tăng hiệu suất của quátrình tinh chế.3.3.Kiểm tra độ tinh sạch của LCA:Chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật điện di trên gelpolyacrylamide để kiểm tra độ tinh sạch của lectin đậu lăngvà xác định trọng lượng phân tử của lectin này. Kết quả thểhiện ở hình 1: Hình 1: Ảnh kết quả điện di các chế phẩm LCA trên gel polyacrylamid Dãy 1: Chế phẩm lectin đậu lăng đã tinh chế qua cột ái-lực Sephadex G75 thể hiện chủ yếu 1 băng có khối lượngphân tử xấp x ...