BÁO CÁO KHOA HỌC: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Nhận dạng cá thể bằng kỹ thuật phân tích ADN trong công tác hình sự là một phương pháp được quan tâm và đi sâu nghiên cứu từ nhiều năm nay bởi các nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới. So với các phương pháp trước đây, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi bật như khắc phục được tình trạng số lượng mẫu quá ít, mẫu bị suy giảm nghiêm trọng do tác động của môi trường và sự che dấu của thủ phạm. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM"ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘTẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUSD7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAMNghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn,Lương Thị Yến,Lê thị Bích Trâm.Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cụcKHKT & CN- Bộ Công anNhận dạng cá thể bằng kỹ thuật phân tích ADN trong côngtác hình sự là một phương pháp được quan tâm và đi sâunghiên cứu từ nhiều năm nay bởi các nhà khoa học ở nhiềunước trên thế giới. So với các phương pháp trước đây,phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi bật như khắc phụcđược tình trạng số lượng mẫu quá ít, mẫu bị suy giảmnghiêm trọng do tác động của môi trường và sự che dấu củathủ phạm. Mặt khác, phương pháp phân tích ADN còn chokết quả với độ chính xác cao, nếu sử dụng từ 6 đến 9 đoạngen sẽ cho một kết quả gần như tuyệt đối [9].Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về các locus gen đahình như D1S80 [1], TH01 [1,4], TPOX [3], D17S5 vàApoB [1]... Trên thế giới, khoảng 12 locus đã được sử dụngrộng rãi trong y học hình sự như TH01, TPOX, D5S818,D7S820... Các locus được lựa chọn này đều mang các alencó trình tự lặp lại ngắn (kích thước cách nhau 4bp). So vớicác đoạn ADN có trình tự lặp lại dài, đoạn lặp lại ngắn cókhả năng ít bị biến tính nên rất có ích lợi trong công tácgiám định.Tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử - Cục Kỹ thuậtHoá-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ-Tổng cục VI-Bộ Công an,chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCRkhảo sát sơ bộ tần suất phân bố các alen của locus D7S820ở một nhóm cá thể người Việt Nam phục vụ công tác nhậndạng cá thể.I. Phương pháp nghiên cứu1. Nguyên liệu:- Máu tươi của những người khoẻ mạnh không có cùngquan hệ huyết thống do Viện Quân y 108 cung cấp.- Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN (hãng Sigma);hoá chất dùng cho quá trình PCR đối với locus D7S820(mồi đặc hiệu cho locus D7S820 của hãng Pharmacia-ThuỵĐiển; Taq ADN polymeraza-của Viện Sốt rét Ký sinh trùngvà Côn trùng Trung ương); hoá chất dùng cho điện di vànhuộm băng ADN (của các hãng Promega, Pharmacia,Sigma, MERCK).2. Phương pháp:a. Tách ADN:ADN từ máu được tách chiết theo phương pháp chuẩn dùngphenol và chloroform để tinh sạch [4]. Kết quả tách chiếtthu được ADN có độ tinh sạch khá cao với OD trung bình1,75 và hàm lượng >50ng/l.b. Kỹ thuật PCR:Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồivà tổng hợp. Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắnmồi khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC. Sản phẩmPCR sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộmethidium bromide (25g/ml).c. Kỹ thuật điện di:Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR đã được kiểm tratrên gel agaroza 2% sau đó được điện di trên gelpolyacrylamide 6% sử dụng ure 7M. Băng ADN được pháthiện bằng phương pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991 [6].d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen * Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alenquan sát được của các mẫu khác nhau trên bản điện di,chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau vàđánh số alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từbăng ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến băngADN có trọng lượng phân tử cao nhất). Việc đánh số ở đâychỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định được cóký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu chưa cóthang alen chuẩn để so sánh.* Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh số, chúng tôiđồng thời chọn ra những mẫu mang những alen khác nhautập hợp lại để tạo thang alen. Thang alen được tạo bằngphương pháp trộn mẫu. * Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các alen đã khảo sátđược theo quy ước quốc tế. Alen của locus D7S820 đượcký hiệu từ 6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi alen. Chúng tôi tiến hành chuẩn thang alen như sau: lấy kếtquả tần suất alen tính được so sánh với tần suất alen đãkhảo sát bằng thang alen chuẩn ở một nhóm người ĐôngNam Á. Chuẩn trước hai alen theo tần suất tương đương(thường chọn alen có tần suất lớn nhất và nhỏ nhất), từ đóký hiệu lại các alen khác theo alen đã chuẩn.II. Kết quả và bàn luận1. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi quá trình PCR :Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các nhiệt độ gắnmồi khác nhau cho thấy: ở tất cả các điều kiện nhiệt độ gắnmồi từ 50oC đến 58oC đều có sự hình thành sản phẩm PCRthể hiện ở sự có mặt của các băng ADN trên bản gelagaroza. Tuy nhiên, ở nhiệt độ gắn mồi 50oC, 52oC, 54oCvà 56oC băng ADN xuất hiện mờ hơn hẳn so với ở nhiệt độgắn mồi 58oC. Điều này chứng tỏ ở nhiệt độ gắn mồi 58oC,quá trình PCR là tối ưu nhất (sản phẩm tạo ra nhiều nhất sovới các nhiệt độ gắn mồi còn lại). Vì vậy, điều kiện đã tốiưu này được chúng tôi sử dụng để thực hiện quá trình PCRđối với các mẫu nghiên cứu (hình 1).Hình 1. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR ở một số mẫu trên gel agaroza theo điều kiện nhiệt độ gắn mồi 58oC2. Kết quả chọn lọc alen và tạo thang alen :Sử dụng các phươ ...