BÁO CÁO KHOA HỌC: UREASE VÀ PROTEASE TRONG THỂ TIẾT CỦA Helicobacter pylori, CHỦNG VNH - 85

Các dịch thể có nguồn gốc từ màng ngoài của Helicobacter pylori mang một số protein là yếu tố bệnh lý như VacA [1], CagA và HP1125 [2, 3]. Các protein đã được xác định là những độc tính gây bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu ở điều kiện invitro cho thấy, các dịch thể có thể xâm nhập vào bên trong tế bào ung thư dạ dày AGS, gây nên sự cường tiết của interleukin IL-8 [4].
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "UREASE VÀ PROTEASE TRONG THỂ TIẾT CỦA Helicobacter pylori, CHỦNG VNH - 85"UREASE VÀ PROTEASE TRONG THỂ TIẾT CỦAHelicobacter pylori, CHỦNG VNH - 85Nguyễn Hoàng Uyên & Nguyễn Thị Hồng HạnhViện Công Nghệ Sinh họcI. MỞ ĐẦUCác dịch thể có nguồn gốc từ màng ngoài của Helicobacterpylori mang một số protein là yếu tố bệnh lý như VacA [1],CagA và HP1125 [2, 3]. Các protein đã được xác định lànhững độc tính gây bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu ởđiều kiện invitro cho thấy, các dịch thể có thể xâm nhậpvào bên trong tế bào ung thư dạ dày AGS, gây nên sựcường tiết của interleukin IL-8 [4]. Có đến 80% số tế bàoAGS bị chết dưới ảnh hưởng của các độc chất chứa trongdịch thể. Những tế bào sống sót đã tăng sinh gấp hai lần[5].Urease là một trong những yếu tố giúp cho vi khuẩnHelicobacter pylori sống trong dạ dày của ngưòi, do phânhuỷ urea và nâng cao độ pH của dịch dạ dày [6,7]. Ureasetổng hợp trong tế bào vi khuẩn và có thể được đưa ra bênngòai theo cơ chế tự autolysis [6, 7].Trong bài báo này, chúng tôi thông báo phát hiện urease vàprotease trong các dịch thể của vi khuẩn Helicobacterpylori, chủng VNH-85 phân lập từ một bệnh nhân ViệtNam bị loét dạ dày. Đây là 2 protein, sau cagA, VacA vàHP1125 được tìm thấy trong các thể dịch của vi khuẩn.Như vậy, sự có mặt của nhiều protein trong dịch thể của vikhuẩn Helicobacter pylori mang các hoạt tính sinh họckhác nhau nhấn mạnh các vai trò chưa biết của chúng trongquá trình phát triển bệnh ở người.II. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP1. Nguyên liệu- Phân lập chủng vi khuẩnVi khuẩn Helicobacter pylori, chủng VHN - 85 được phânlập và nuôi cấy như đã miêu tả [8]. Sau khi nuôi ở điều kiệnchuẩn trong ba ngày, vi khuẩn được thu thập cho cácnghiên cứu tiếp.2. Phương pháp- Tách chiết các dịch thểCác dịch thể được thu nhận như đã miêu tả [9]. Chế phẩmđược bảo quản ở –200C trong vòng một năm.- Xác định hoạt tính ureasea) Các dịch thể được ủ trong 0,.2 ml dung dịch đệmphosphate pH = 6 (Urea 2%; NaH2PO4 0.428% vàNa2HPO4 1% ) trong 30 phút ở 370 C. 10 l của phản ứngđược lấy ra ở các thời điểm khác nhau để xác định hàmlượngNH3b) bằng phương pháp Berthellot.NH3 được xác định theo phương pháp của Berthellot nhưsau:Chuẩn bị ba dung dịch có thành phần:1) 2% Na - phenolate2)50 gram Na Nitroprusside trong 1 lit nước cất3)15% NaOClCác dung dịch được chuẩn bị và bảo quản lạnh.Phản ứng định lượng màu được tiến hành như sau: Cho 0.1- 1 l mẫu vào ống nghiêm sạch và 2 ml nước cất. Chothêm vào ống nghiệm 3 dung dịch đã chuẩn bị như trêntheo thứ tự 1ml dung dịch 1; 0. 5 ml dung dịch hai và ba.Lắc ống nghiệm sau mỗi lần cho chất vào. Các ống nghiệmđược ủ ở nhiệt độ phòng khỏang 30 phút, sau đó tiến hànhđo OD ở bước sóng 630nm. Đường chuẩn được xây dưngcho các hàm lượng NH3 là 0-5 g. Phương pháp cho phépxác định lượng NH3 nhỏ nhất là 0.5 g.- Xác định hoạt tính protease của các dịch thểSự có mặt của các protease trong dịch thể được xác địnhbằng phương pháp SDS-PAGE zymogram protease. Tủadịch thể trong cồn tuyệt đối (1:1) ở –200C. Ly tâm tủa ở4oC trong 15 phút, sau đó hoà tủa trong nước cất để chạyđiện di SDS-PAGE 70V trong 2 giờ. Sau SDS-PAGE, ủ geltrong dung dịch 3% casein đệm Tris-HCl 50 mM, pH 8 ở400C trong vòng 30 phút, sau đó rửa sạch gel trong nướccất và nhuộm bằng dung dịch 40% ethanol, 10% acidacetic, 0.1 % Coomasie Blue trong 4 giờ. Sau khi tẩy trongdung dịch 40% ethanol., 10% acid acetic, băng protein cóhoạt tính protease hiện lên màu trắng. Protein albuminchuẩn được sử dụng làm đối chứng.III - KẾT QUẢ1. Phát hiện sự thay đổi pH của dịch đệmCác dịch thể sau khi được tách chiết từ dịch nổi nuôi cấycủa vi khuẩn Helicobacter pylori bằng phương pháp siêu lytâm được ủ trong dung dịch đệm có pH = 6,9. Sau một vàiphút, màu của dung dịch đã đổi từ vàng sang đỏ, chứng tỏcó sự thay đổi pH từ vùng acid sang vùng kiềm ( hình 1).Tính chất nói trên được bảo toàn khi tiến hành thí nghiệmvới các chế phẩm được bảo quản ở - 20oC trong nhiều năm.2. Xác định NH3 giải phóng ra trong phản ứng sinh hoáSự dịch chuyển pH của dung dịch đệm có thể do một chấtnào đó có bản chất kiềm đã xuất hiện trong quá trình ủ dịchthể với urea. Trong trường hợp, dung dịch đệm không chứaurea, hiện tượng chuyển dịch pH đã không xẩy ra. Như thế,các kết quả cho phép kết luận urea chính là cơ chất củaphản ứng sinh hoá mà chúng tôi vừa trình bầy.Các phân tích sử dụng phương pháp của Berthellot để xácđịnh NH3 cho thấy NH3 đã được giải phóng trong quá trìnhmen học nói trên (hình 2a và 2b). Trên biểu đồ, thời giancần thiết (lag time) để bắt đầu phản ứng hoá học là 15 phút.Tốc độ giải phóng NH3 tỷ lệ thuận với thời gian của phảnứng.3. Xác định hoạt tính protease của các dịch thể.Hoạt tính protease của các dịch thể được phát hiện khi gelđược tẩy bằng dung dịch 40% ethanol và 10% acid acetic(hình 3). Trên ảnh chụp, ít nhất một băng protein có phântử l ...