BÁO CÁO KHOA HỌC: XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN MẠCH VÒNG

Các ADN mạch vòng được phát hiện trong nhân của vi khuẩn, trong ty thể, trong các lục lạp của thực vật cũng như của động vật [1, 2, 3]. Một ADN vòng có thể là một đơn thể (1a) hoặc một nhị thể với các cấu hình khác nhau. Các ADN mạch vòng gồm hai phần hệt nhau có thể được sắp xếp đối xứng (1b) hoặc không đối xứng (1c).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN MẠCH VÒNG"XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADNMẠCH VÒNGNguyễn Thị Hồng HạnhViện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG.I. MỞ ĐẦUCác ADN mạch vòng được phát hiện trong nhân của vikhuẩn, trong ty thể, trong các lục lạp của thực vật cũng nhưcủa động vật [1, 2, 3]. Một ADN vòng có thể là một đơnthể (1a) hoặc một nhị thể với các cấu hình khác nhau. CácADN mạch vòng gồm hai phần hệt nhau có thể được sắpxếp đối xứng (1b) hoặc không đối xứng (1c).Trong điện trường của điện di thông thường, các ADNmạch thẳng và ADN mạch vòng dịch chuyển trên cùng mộtquĩ đạo. Tuy nhiên, trong từ trường của điện di xung -PFGE, dưới ảnh hưởng của các vector không cân xứng vớihiệu điện thế và thời gian tác động khác nhau [4], các ADNmạch thẳng và mạch vòng dịch chuyển trên các quĩ đạohoàn toàn riêng biệt và vì vậy có thể xa rời nhau. Dựa trênnguyên tắc trên, điện di xung –PFGE không cân xứng đãđược sử dụng để phân biết và phân giải các ADN có cáccấu trúc khác nhau Hình 1- Các ADN mạch vòng có thể là một đơn phân (a), nhị phân đối xứng gồm hai nửa giống nhau sắp sếp theokiểu đầu - chụm - đuôi (b) hoặc không đối xứng có cấu trúc đầu - chụm - đầu (c).Nguyên sinh động vật Leishmania sống ký sinh trong cácđại thực bào của người và động vật. Các bệnh mà ký sinhtrùng gây nên thường khác nhau, do Leishmania có một hệgenom rất mềm dẻo và luôn thay đổi. Các yếu tố di truyềnmạch vòng có nguồn gốc từ một nhiễm sắc thể mẹ thườngđược phát hiện trong nhân của chúng. Các ADN mạch vòngthường có cấu trúc khác nhau. Mạch vòng CD1 trong L.Major là một nhị phân có cấu trúc đặc biệt gồm hai nửagiống nhau nhưng xếp đặt theo kiểu đầu chụm đầu, trongkhi đó mạch vòng CD1 của Leishmania mexicana M379 cóthể là một nhị phân [5]Trong bài báo này, chúng tôi trình bầy các phương phápđược sử dụng để xác định phân tử lượng của yếu tố ditruyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 của nguyên sinh động vậtLeishmania M379 nói riêng và của các ADN mạch vòngnói chung. Phương pháp đã được sử dụng có kết quả để xácđịnh phân tử lượng của một mạch vòng mini trong hệ genty thể của nguyên sinh động vật Leishmania [6].II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.1. Nguyên liệuNguyên sinh động vật Leishmania M379 thuộc chủngGarnham (G1) được nuôi trên môi trường GLSH có bổxung 10% huyết thanh bê [7] ở nhiệt độ 26o C và cấychuyển hai lần một tuần.2. Phương pháp- Tách chiết ADN.Nguyên sinh động vật Leishmania được nuôi trong môitrường GLSH đến giai đoạn log để tách chiết ADN. Kýsinh trùng được ủ trong dung dịch tan (100 mM Tris pH 9 ,200 mM EGTA, 2% EDTA và RNA-ase) trong 2 giờ ở37oC. Sau khi bổ xung proteinase K (20g / ml) mẫu đượcủ tiếp trong vài giờ ở 55oC. ADN được làm sạch và táchchiết bằng phenol.- Cắt ADN của LeishmaniaCác men ClaI và Xbal ( Promega) ở các nồng độ khác nhauđược dùng để cắt ADN của Leishmania. Phản ứng cắt đượctiến hành ở 37oC trong 2 giờ.- Chuẩn bị PFGE blockNguyên sinh động vật Leismania nuôi ở giai đoạn log đượcdùng để chuẩn bị PFGE block theo phương pháp của Vander Ploeg [8]- Đánh dấu đồng vị phóng xạPhân tử mạch vòng CD1 được tách bằng phương pháp điệndi xung PFGE [9]. Chúng được cắt với EcoRI trước khiđược đánh dấu phóng xạ với 32 P theo phương pháp đãđược công bố [10]- Kỹ thuật điện di xungCác phân tích PFGE nhằm phân tách các nhiễm sẵc thểđược tiến hành như đã được miêu tả [9]- Lai Southern và các phép đo đồng vị phóng xạLai Southern được tiến hành theo các phương pháp chuẩn[10]. Các tín hiệu lai phóng xạ được phát hiện trên phimKodak X trong vòng 24 giờ.II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬNCắt hạn chế và lai Southern để xác định phân tử lượngcủa CD1Nhằm xác định phân tử lượng của yếu tố di truyền ngoàinhiễm sắc thể CD1, ADN genome của Leishmania, chủngG1 được cắt hoàn toàn với men ClaI. Các đoạn cắt đượcphân giải bởi điện di PFGE trong 7 giờ và lai Souther vớiCD1 đánh dấu đồng vị phóng xạ.Như đã thấy ở hình 2, mạch vòng CD1 dường như có phântử lượng khoảng 28 kb, vì khi cắt CD1 với ClaI, bốn đoạnADN với phân tử lượng là 3, kb ; 5., 2 kb ; 6 kb và 13 kbđã được phát hiện như mong đợi.Hình 2- Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 có trọng lượng phân tử khoảng 28 kb. Bốn đoạn ADN với kích thước thứ tự từ trên xuống dưới 1 (13 kb); 2 ( 6 kb); 3 (5,2kb) và 4 (3, 7 kb) là sản phẩm cắt hoàn toàn của CD1 với Cla I Xác định cấu trúc của mạch vòng CD1.Việc xem xét phân tử lượng của CD1 được khởi xướng khirất ngẫu nhiên một đoạn ADN có phân tử lượng  56 kbđược phát hiện trong điện trường cuả điện di không cânxứng PFGE. Đoạn ADN này lai đặc trưng với CD1 (hình 3)và không lai với các ADN khác. Chúng tôi giả thiết đoạnADN mới phát hiện có thể có nguồn gốc từ CD1 với phântử lượng là 56 kb, nó là một nhị nguyên, cấu tạo từ hai nửagiống nhau theo kiểu đầu – chụm - đuôi.Các kết quả thực ng ...