BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT: IDENTIFICATION BY METABOLIC SCREENING OF GENEES INVOLVED IN THE COUMARINS BIOSYNTHESIS PATHWAY OF Arabidopsis thaliana

Bộ môn Công Nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm TP.HCM, Việt Nam (**) Phòng thí nghiệm Agronomie environnement, ENSAIA-INPL Nancy, Pháp ABTRACT Coumarins là chất chuyển hóa thứ cấp liên quan đến cơ chế phản ứng với stress và sự thích nghi của các nhà máy để họ điều kiện môi trường.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT: IDENTIFICATION BY METABOLIC SCREENING OF GENEES INVOLVED IN THE COUMARINS BIOSYNTHESIS PATHWAY OF Arabidopsis thaliana NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 194 XAÙC ÑÒNH MOÄT SOÁ GENE THAM GIA CON ÑÖÔØNG SINH TOÅNG HÔÏP CAÙC HÔÏP CHAÁT COUMARIN ÔÛ CAÂY Arabidopsis thaliana BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP CHOÏN LOÏC CHUYEÅN HOÙA IDENTIFICATION BY METABOLIC SCREENING OF GENEES INVOLVED IN THE COUMARINS BIOSYNTHESIS PATHWAY OF Arabidopsis thaliana Nguyeãn Vuõ Phong (*), Alain Hehn (**), Freùdeùric Bourgaud (**) (*) Boä moân Coâng ngheä Sinh hoïc, Ñaïi hoïc Noâng Laâm TP.HCM, Vieät Nam (**) Laboratoire Agronomie Environnement, ENSAIA-INPL Nancy, Phaùp ABTRACT bieán chuùng theo höôùng coù lôïi cho saûn xuaát ñang raát ñöôïc quan taâm (Bourgaud vaø ctv., 2006). Coumarins are secondary metabolites involved in the mechanism of response to stress and Con ñöôøng sinh toång hôïp caùc chaát coumarin xuaát adaptation of plants to their environmental phaùt töø söï bieán ñoåi cinnamic acid theo hai höôùng. conditions. Although their important roles the Höôùng thöù nhaát baét ñaàu bôûi söï hydroxylation vò trí coumarin biosynthesis pathway is poorly thöù 2 (ortho) cuûa nhaân voøng thôm taïo ra coumarin understood. The objective of this work was to carry ñöôïc mieâu taû trong chloroplast cuûa caây Melilotus out metabolic profiles of Arabidopsis thaliana alba (Kindl, 1971; Gestetner vaø Conn, 1974) vaø trong mutants insertional and to try to characterize the caùc microsome ôû caây caø chua (Czichi vaø Kindl, 1975). ortho-hydroxylation step at the molecular level. Con ñöôøng thöù hai baét ñaàu bôûi söï hydroxylation cinnamic acid taïi vò trí thöù 4 nhaân voøng thôm bôûi The HPLC (high performance liquid cinnamate-4-hydroxylase, moät monooxygenease chromatography) analysis on 8 different mutants trong gia ñình caùc P450. Phaûn öùng naøy laø ñieåm khôûi showed that 3 of them (CYP78A6, CYP84A4 and ñaà u cuû a caù c con ñöôø n g toå n g hôï p caù c CYP706A2) exhibit 5 fold weaver scopoletin phenylpropanoids nhö caùc coumarins, flavonoids, content than the wild-type. In order to test the lignins. Scopoletin, esculetin vaø umbelliferon ñöôïc taïo ra ñaàu tieân bôûi phaûn öùng ortho-hydroxylation implication of these P450 in the biosynthesis pathway, we cloned the genees and programmed tuaàn töï caùc ferrulic acid, cafeic acid vaø 2’,4’ to express the corresponding protein in a yeast dihyroxycinnamic acid vaø phaûn öùng lactonization ngaãu nhieân (Bourgaud vaø ctv, 2006). expression system. As the genes seemed not to be constitutively expressed, plants were treated to enhance the expression level. We could amplify and clone CYP84A4 from mRNA extracted from plants treated by wounding after 1 and 4h, and by 2,4D after 24h. Yeast expression will now be performed for CYP84A4 and CYP706A2 and a metabolic screening will be realized. Key words: Arabidopsis thaliana; scopoletin; biosynthesis of coumarins; P450 cytochrome; heterologue expression. MÔÛ ÑAÀU Coumarins laø nhoùm hôïp chaát thöù caáp coù vai troø Hình 1. Moät phaàn con ñöôøng sinh toång hôïp quan troïng trong cô cheá phaûn öùng vôùi stress vaø söï thích öùng cuûa caây ñoái vôùi moâi tröôøng soáng. Söï sinh caùc coumarin ôû thöïc vaät baäc cao toång hôïp cuûa caùc chaát naøy thöôøng ñöôïc kích thích (Theo Bourgaud vaø ctv., 2006) bôûi caùc stress do taùc nhaân sinh hoïc hoaëc khoâng sinh hoïc gaây neân. Beân caïnh ñoù, caùc hôïp chaát naøy coøn ÔÛ caây Arabidopsis thaliana, Kai vaø ctv., (2006) ñöôïc söû duïng roäng raõi trong y hoïc vaø saûn xuaát caùc ñaõ phaùt hieän löôïng umbelliferon ôû daïng veát vaø loaïi myõ phaåm. Maëc duø vaäy, con ñöôøng sinh toång scopoletin cuøng vôùi scopolin vôùi soá luôïng lôùn baèng hôïp caùc hôïp chaát coumarin vaãn chöa ñöôïc hieåu roõ. phöông phaùp saéc kyù loûng cao aùp HPLC (High Ngaøy nay, vieäc nghieân cöùu caùc enzyme tham gia performance liquid chromatography). Ñeå xaùc ñònh trong con ñöôøng sinh toång hôïp caùc hôïp chaát thöù gene maõ hoùa cho enzyme xuùc taùc phaûn öùng ortho- caáp, nhaát laø caùc cytochrome 450 (P450), nhaèm caûi Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007 Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT 195 hydroxylation, trong phaïm vi cuûa nghieân cöùu naøy, vieäc taùi toå hôïp gen quan taâm trong plasmid 8 doøng Arabidopsis thaliana ñoät bieán baèng phöông pYeDP60. Phaûn öùng PCR ñöôïc thöïc hieän vôùi 1µl phaùp chuyeån T-DNA (phöông phaùp knockout gen) DNA maãu; 5µl 10X Amplification Buffer; 1µl dNTP ñöôïc ñònh löôïng umbelliferon vaø scopoletin baèng Mix 10mM; 1,5µl MgCl2- 50mM; 5µl p ...