Báo cáo nghiên cứu khoa học: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG E. COLI BL21

β-galactosidase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-D galactoside trong phân tử đường lactose thành glucose và galactose, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, trong y học để chế biến thuốc hỗ trợ tiêu hoá. Trên thế giới, đã có một số công...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo nghiên cứu khoa học: " NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG E. COLI BL21"TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG E. COLI BL21 Tr n V n Giang ầ ă Tr ng i h c S ph m, i h c Hu ờư ạĐ ọ ư ạĐ ạ ọ ế TÓM TẮT -galactosidase là enzyme xúc tác ph n ng thu phân liên k t – 1,4-D galactoside β ứả ỷ βếtrong phân t ng lactose thành glucose và galactose. bi u hi n c enzyme này trong E. ờưđ ử ể ểĐ ợưđ ệcoli BL21, chúng tôi ã ti n hành chèn gene ích ã tinh s ch vào vector bi u hi n pET, sau ó đ ế đ đ ạ ể ệ đchúng tôi ã tinh s ch vector tái t h p, ti n hành bi n n p vào t bào E. coli BL21 và ã bi u đ ạ ợổ ế ế ạ ế đ ểhi n c protein này nhi t và pH thích h p sau khi c m ng v i IPTG. ợưđ ệ ở ộđ ệ ợ ứả ớ1. Mở đầu β-galactosidase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-Dgalactoside trong phân tử đường lactose thành glucose và galactose, được ứng dụngrộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, trong y học để chế biến thuốc hỗ trợ tiêu hoá.Trên thế giới, đã có một số công trình công bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidasetừ Lactobacillus reuteri 103 [1] và Bacillus megaterium [2]. Ở Việt Nam, Nguyễn VănCách (2008) đã tạo dòng β-galactosidase từ Aspergillus oryzae và xác định một số tínhchất lý-hóa của nó [3]. Trần Văn Giang, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008)đã tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilisG1 [4]. Nhiều người khi uống sữa có hiện tượng đau bụng và tiêu chảy do bị dị ứng vớiđường lactose trong sữa, đây là một dạng đường chủ yếu trong thành phần sữa. Sau khiuống sữa nếu bị khó tiêu, đầy hơi, sôi bụng hay tiêu chảy, đau bụng thì chắc chắn họ bịdị ứng với lactose trong sữa. Lactose khi vào đến ruột sẽ được thủy phân thànhgalactose và glucose nhờ vào enzyme lactase (β-galactosidase ở vi khuẩn) có ở thànhruột non. Trong trường hợp thiếu lactase, lactose không được thủy phân sẽ bị tống rangoài dưới dạng tiêu chảy. Những người không tiêu hóa được lactose do họ thiếu lactasebẩm sinh hoặc lactase bị thoái hóa từ thuở thơ ấu. Trên thế giới và Việt Nam đã có một số nghiên cứu về β-galactosidase có nguồngốc từ các sinh vật. Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu về β-galactosidase mớidừng lại ở nghiên cứu cơ bản và chưa đưa vào sản xuất enzyme này [3]. Vì vậy, cầnnghiên cứu biểu hiện β-galactosidase để làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme này và gópphần giúp các nhà sản xuất sữa Việt Nam có thêm sản phẩm sữa dễ tiêu hóa. 892. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu và hóa chất Chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp β-galactosidase đã được tuyển chọnBaccillus subtilis G1 [4]. Vector pET22b(+) (Invitrogen) dùng để biểu hiện β-galactosidase trong E. coli BL21. Các thiết bị và hóa chất để biểu hiện được PhòngCông nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công NghệViệt Nam cung cấp. 2.2. Khuếch đại gen bằng PCR Để khuếch đại gen mã hóa β-galactosidase của chủng Bacillus subtilis G1, sửdụng mồi xuôi GalF: 5-GCG GAT CCG GTG ATG TCA AAG CTT GAA AAA ACGC-3 và mồi ngược GalR: 5-GCG CGG CCG CAT GTG TGT TTA CGA CAA T-3,được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide của gen mã hóa β-galactosidase B. subtilis trênGenBank (mã số NC_000964), có bổ sung điểm cắt hạn chế BamHI và NotI để chènvào vector biểu hiện pET-22b(+). Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm 10xPCR; 2 µl 2,5 mM dNTP; 2 µl 25 mM MgCl2; 1 µl (0,1µg/ml)DNA khuôn mẫu; 0,5 µl(5u/µl )Taq polymerase và 1 µl (10u/µl) mồi mỗi loại bổ sung nước cất đến thể tích 25µl. Phản ứng được thực hiện trong điều kiện: 94°C/3 phút; 35 chu kỳ: 94°C/1 phút,54°C/1 phút, 72°C/1 phút; cuối cùng 72°C/10 phút. 2.3. Gắn sản phẩm PCR Phản ứng gắn sản phẩm PCR từ vector tạo dòng với vector biểu hiện gồm: 2 µlđệm gắn dính DNA T4 10x; 3µl DNA tinh sạch; 3 µl ...