Báo cáo nghiên cứu khoa học NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN GEN H5 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 PHÂN LẬP TỪ VỊT TẠI THỪA THIÊN - HUẾ

Phân đoạn gen HA(H5) của một chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế (ký hiệu A/Dk/Vietnam/Hue/2004) đã được thu nhận bằng phương pháp RT-PCR, dòng hoá, giải trình trình tự, so sánh thành phần gen và phân tích quan hệ phả hệ. Gen H5 của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 (Thừa Thiên-Huế) có tỷ lệ tương đồng cao so với các chủng từ các vùng miền khác của Việt Nam (Hậu Giang, Tiền Giang và Cà Mau) và có thể cùng nguồn gốc dòng Quảng Đông với các chủng cúm A/H5N1 này. ...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo nghiên cứu khoa học " NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN GEN H5 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 PHÂN LẬP TỪ VỊT TẠI THỪA THIÊN - HUẾ " NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN GEN H5 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 PHÂN LẬP TỪ VỊT TẠI THỪA THIÊN - HUẾ Trần Quang Vui Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Lê Thanh Hoà Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam TÓM TẮT Phân đoạn gen HA(H5) của một chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ vịttại Thừa Thiên - Huế (ký hiệu A/Dk/Vietnam/Hue/2004) đã được thu nhận bằngphương pháp RT-PCR, dòng hoá, giải trình trình tự, so sánh thành phần gen vàphân tích quan hệ phả hệ. Gen H5 của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 (ThừaThiên-Huế) có tỷ lệ tương đồng cao so với các chủng từ các vùng miền khác củaViệt Nam (Hậu Giang, Tiền Giang và Cà Mau) và có thể cùng nguồn gốc dòngQuảng Đông với các chủng cúm A/H5N1 này. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của mọiloài chim, kể cả gia cầm và thủy cầm, do các phân týp (subtype) của nhóm viruscúm A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. H5N1 là một phân týp có độc lực cao, xuất hiện gần đây tại các n ước châuÁ, châu Âu, châu Phi và được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động vậtsang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gia cầm những năm1996-2008. Ở Việt Nam, những vụ dịch cúm gia cầm do H5N1 đ ã xảy ra trên toànbộ đất nước, hàng triệu gia cầm bị chết và bị tiêu huỷ, gây thiệt hại lớn cho nềnkinh tế quốc dân. Virus cúm A chứa hệ gen ARN một sợi âm bao gồm 8 phân đoạn (PB2,PB1, PA, HA, NP, NA, MA, NS), trong đó phân đoạn 4 mã hoá cho proteinhemagglutinin (HA) là một protein thụ thể có vai trò bám dính vào tế bào chủ vàlà kháng nguyên bề mặt chịu trách nhiệm độc lực trong cơ chế gây bệnh của virus.Virus cúm gia cầm có khả năng tái tổ hợp biến chủng để thích nghi và rất dễ thayđổi cấu trúc kháng nguyên (Lê Thanh Hòa và cs, 2004). Hiện nay, các phươngpháp sinh học phân tử đã được sử dụng để thu nhận một phần hoặc toàn bộ genH5N1, xác định đặc tính sinh học phân tử, định loại subtype, giải tr ình trình tự, sosánh phân tích số liệu và xem xét di truyền quần thể, tiến hóa nguồn gốc của cácbiến chủng H5N1 (Wan và cs, 2005; Lê Thanh Hòa, 2006). Trong bài báo này chúng tôi so sánh thành phần gen H5 của một chủngvirus cúm A/H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế và phân tích quan hệ phảhệ với các chủng khác của Việt Nam. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Bệnh phẩm là dịch khí quản-phế quản chứa virus cường độc cúm A/H5N1thu thập từ vịt tại Thừa Thiên - Huế năm 2004 (A/Dk/Vietnam/Hue/2004) đã đượcvô hoạt bằng nhiệt độ, bảo quản ở -20oC. Các loại sinh phẩm đã được sử dụng trong nghiên cứu: i) Bộ kit QIAampViral Mini kit (QIAGEN Inc.) tách chiết ARN hệ gen của virus; ii) Bộ kit One-step RT-PCR của hãng Invitrogen thực hiện phản ứng RT-PCR; iii) Bộ kitQIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.); iv) Bộ kit TOPO-TA cloning(Invitrogen) dùng dòng hóa sản phẩm; v) Chủng vi khuẩn E. coli DHα-T1; vi) Bộkit QIApreps Spin Miniprep (QIAGEN Inc.) sử dụng tách ADN của các plasmidtái tổ hợp; vii) Bộ kit DyeEx 2.0 Spin Kit (QIAGEN Inc.) dùng tinh sạch phản ứnggiải trình tự. Tách ARN hệ gen của virus ARN hệ gen của virus được tách chiết bằng bộ kit QIAamp Viral Mini kit(QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thiết kế mồi và thực hiện phản ứng RT-PCR Cặp mồi dùng cho phản ứng RT-PCR thu nhận toàn bộ gen H5: Mồi xuôi H5BAMF: 5CGGGATCCTCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTGCTT3, tương ứngvị trí 19-34 trong phân đoạn 4, có bố trí điểm cắt của enzyme giới hạn BamHI(gạch bên dưới). Mồi ngược H5NOTR: 5ATAAGAATGCGGCCGCTCATTAAATGCAAATTCTGCATTGTAACGA3, tương ứng vị trí 1708-1735 trong phân đoạn 4, có bố trí điểm cắt củaenzyme giới hạn NotI (gạch bên dưới). Toàn bộ phân đoạn HA của chủng A/Dk/Vietnam/Hue/2004 có độ d àikhoảng 1700 bp được thu nhận bằng phản ứng RT-PCR một bước với cặp mồiH5BAMF - H5NOTR, theo chu trình nhiệt như sau: 50oC/60 phút, 95oC/15 phút,35 chu kỳ [94oC/1 phút, 55oC/30 giây, 72oC/2 phút], 72oC/10 phút, sau chu kỳcuối cùng bảo quản sản phẩm ở 4oC cho đến khi kiểm tra và tinh sạch sản phẩm. Kiểm tra sản phẩm RT-PCR, tinh sạch và dòng hóa sản phẩm vàovector tách dòng Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra trên agarose 1%, được tinh sạch bằng bộkit QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn. Gen HA trong sảnphẩm sau khi tinh sạch được dòng hóa vào vector pCR2.1TOPO (Invitrogen). Cácphản ứng nối ghép gen, chuyển nạp plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháptạo sốc nhiệt được tiến hành theo đúng q ...