Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp Nghiên cứu kỹ thuật PCR chuẩn đoán virut gây bệnh ở tôm sú

Bệnh đốm trắng (White spot syndrom virut - WSSV) đã và đang gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm sú không chỉ ở Châu á mà còn trên toàn thế giới (Flegel và ctv., 1997). Bệnh đốm trắng đã phát hiện ở trên một số loài tôm khác nhau: P. monodon, P. japonicus và L. vannameit....WSSV nhiễm ở tôm bố mẹ có thể truyền sang tôm giống (Lo và ctv., 1997), tôm giống mang mầm bệnh sau 1-2 tháng đầu thả nuôi phát triển bình thường, nhưng sau đó khoảng 80% số ao nuôi phát hiện bệnh đốm trắng...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo nghiên cứu nông nghiệp " Nghiên cứu kỹ thuật PCR chuẩn đoán virut gây bệnh ở tôm sú " Nghiên cứu kỹ thuật PCR chuẩn đoán virut gây bệnh ở tôm sú Nguyễn Thị Tần, Lê Quang Hưng, Phạm Anh Tuấn Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản IĐặt vấn đềBệnh đốm trắng (White spot syndrom virut - WSSV) đã và đang gây thiệt hại lớn cho nghềnuôi tôm sú không chỉ ở Châu á mà còn trên toàn thế giới (Flegel và ctv., 1997). Bệnh đốmtrắng đã phát hiện ở trên một số loài tôm khác nhau: P. monodon, P. japonicus và L.vannameit....WSSV nhiễm ở tôm bố mẹ có thể truyền sang tôm giống (Lo và ctv., 1997), tômgiống mang mầm bệnh sau 1-2 tháng đầu thả nuôi phát triển bình thường, nhưng sau đókhoảng 80% số ao nuôi phát hiện bệnh đốm trắng và gây chết hàng loạt. Nghiên cứu pháthiện bệnh đốm trắng bằng nhiều phương pháp khác nhau như mô bệnh học, nhuộm tươi vàPCR. Trong đó kỹ thuật PCR chính xác và nhạy cảm cao, cho phép phát hiện nhanh ngay từkhi tôm mới nhiễm bệnh ở giai đoạn sớm, do đó ngày nay phương pháp này được sử dụngrất rộng rãi.Để phát triển bền vững nghề nuôi tôm, rất nhiều tác giả nghiên cứu phát hiện bệnh đốm trắngbằng phương pháp PCR với các cặp mồi khác nhau. (Kasornchandra và ctv., 1998) sử dụngcặp mồi 102F1&102R1 cho PCR đơn phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở sáunước Châu á. Kim và ctv (1998) cũng sử dụng cặp mồi 1F&1R1 cho PCR đơn phát hiệnWSSV trên tôm ở Hàn quốc. Lo và ctv.,(1996 a,b) sử dụng các cặp mồi146F1&146R1,146F2&146R2 cho PCR lồng trên tôm ở Đài Loan. Peng và ctv.,(1998), Chouvà ctv., (1998) nghiên cứu phát hiện WSSV với cặp đoạn mồi theo nghiên cứu của Lo (1996)với các chu kỳ nhiệt khác nhau.Như vậy, có rất nhiều quy trình khác nhau để phát hiện WSSV. Tuy nhiên việc ứng dụngcác quy trình này và tìm ra quy trình tối ưu cho việc phát hiện bệnh đốm trắng ở tôm nuôi tạiViệt Nam là lĩnh vực nghiên cứu hoàn toàn mới. Nhằm đáp ứng mục tiêu phát hiện nhanhWSSV, hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra, và tìm ra quy trình tối ưu nhằm ứngdụng rộng rãi trong chuẩn đoán phát hiện WSSV trên tôm nuôi tại Việt nam, chúng tôi tiếnhành những nội dung nghiên cứu sau: 1. Các phương pháp tách chiết ADN 2. Pháp phát hiện bệnh đốm trắng bằng PCR đơn với các chu kỳ nhiệt khác nhau 3. Phát hiện bệnh đốm trắng bằng PCR lồng với các chu kỳ nhiệt khác nhau 4. Chạy PCR phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở các mẫu mô khác nhau 5. Phát hiện bệnh bằng phương pháp PCR Kit 6. ứng dụng quy trình PCR tối ưu cho việc phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú ở một số tỉnh miền Bắc và miền Trung. 1Phương pháp nghiên cứu1. Thu mẫu: Tất cả các mẫu được thu từ Nha Trang, Bình Thuận và Ninh Thuận Stt Quần đàn Số mẫu Kết quả theo mô bệnh học 1 Nha Trang I 10 10 (++) 2 Nha Trang II 10 10 (+) 3 Ninh Thuận I 10 4 (+); 2 (-); 3 (++) 4 Bình Thuận IV 10 10 + 5 Bình Thuận V 10 10 + 6 Ninh Thuận II 3 3+2. Tách chiết ADN2.1. Phương pháp 1 Lấy một phần chân bơi hoặc mô cơ, nếu tôm nhỏ ta lấy mẫu cả con, rửa sạch. Nghiền 1 lượng mẫu khoảng 0,05g trong 900 µl Cell Lysis Solution. Dùng RNase - A (10mg/ml) loại ARN, kết tủa protein bằng 7.5 M Amonium Acetate, dùng cồn 960 để kết tủa ADN. Sau đó ADN được hoà tan trong đệm TE hoặc nước cất tinh khiết, bảo quản ở 40C.2.2. Phương pháp 2 Dùng phenol, chloroform, isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1). Kết tủa ADN bằng cồn 960 hoặc isopropanol. Sau đó ADN được hoà tan trong đệm TE hoặc nước cất tinh khiết, bảo quản ở 40C.2.3. Phương pháp 3 Dùng Lysis Buffer trong bộ kit IQ2000-WSSV, Đài Loan3. Phản ứng PCR3.1. Phương pháp 1: PCR đơnTrình tự các đoạn mồi sử dụng cho phương pháp PCR đơn 102F1: 5’ - TCA CAT CGA GAC CTC TGT AC - 3’ và 102R1: 5’ - TCT AGG ACG GAC TAT GGC - 3’(Kaornchandra và ctv., 1998), bệnh bắt cặp lên ở 520bp. 1F: 5’ - ATC TGA TGA GAC AGC CCA AG - 3’ 2 và 1R: 5’ - GGG AAT GTT AAA TAT GTA TCG G - 3’ (Kim và ctv., 1998), bệnh bắt cặp lên ở 365bp.3.2. Phương pháp 2: PCR lồng Trình tự các đoạn mồi sử dụng cho phương pháp PCR lồng (Lo và ctv., 1996) Cặp mồi cho PCR lần 1: 146 F1: 5 - ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT CG - 3 146 R1: 5 -TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A - 3. bệnh bắp cặp lên ở 1447bp Cặp mồi cho PCR lần 2: 146 F2: 5 - GTA ACT GCC CCT TCC TCC ATC CTC CA - 3 146 R2: 5 - TAC GGC TGC T ...