Báo cáo TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG

Để nâng cao hiệu quả thụ tinh nhằm nhân nhanh đ àn bò sữa, việc áp dụng vi tiêm (microinjection) tinh trùng vào bào tương tr ứng là cần thiết. Trứng bò thu nhận từ nhiều nguồn đ ược nuôi trưởng thành trong TCM 199 v ới 20% FBS (Fetal Bovine Serum). Tinh trùng bò s ữa đông lạnh được hoạt hoá bằng ph ương pháp swim-up trong môi trường BO. Sau khi vi ti êm, trứng được hoạt hoá
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Báo cáo " TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG " 337Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT TẠO PHÔI B Ò BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TR ỨNG Trần Thị Thanh Khương, Đặng Ho àng Lâm, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc ĐH Khoa học Tự nhi ên TPHCMMỞ ĐẦU Để nâng cao hiệu quả thụ tinh nhằm nhân nhanh đ àn bò s ữa, việc áp dụng vitiêm (microinjection) tinh trùng vào bào tương tr ứng l à cần thiết. Trứng b ò thunh ận từ nhiều nguồn đ ược nuôi trưở ng thành trong TCM 199 v ới 20% FBS (FetalBovine Serum). Tinh trùng bò s ữa đông lạnh được hoạt hoá bằng ph ương phápswim-up trong môi trường BO. Sau khi vi ti êm, tr ứng được hoạt hoá. Sau 9 lầnthực hiện với 44 trứng tạo, đ ược 20 phôi, với tỷ lệ th ành công là 47,17% và phôiđạt giai đoạn morula l à 10%. ICSI - Intracytoplasmic sperm injection là phương pháp vi tiêm m ột tinh tr ùngđược lựa chọn từ trước đó vào bào tương trứng, với sự hỗ trợ của hệ thống vi thao táccùng với kính hiển vi đảo ngược. Kỹ thuật n ày ra đời vào năm 1992 do Palemo và cs đ ãứng dụng thành công trên người. ICSI như là một cuộc cách mạng trong hỗ trợ sinh sảnđặc biệt trong chữa trị vô sinh nam. Đối với gia súc, sau khi thực hiện ICSI, tế b ào trứng có chứa tinh tr ùng phải trảiqua quá trình ho ạt hoá với các tác nhân nh ư xung điện, ethanol 7%, Calcium Ionophore(A23187)… T ạo phôi b ò b ằng phương pháp vi tiêm đ ã m ở ra hướng mới trong nhân giốngbò đem lại hiệu quả cao, đặc biệt l à bò s ữa trong trường hợp nguồn giao tử có chấtlượng kém hoặc ngu ồn trứng đông lạnh. B ên c ạnh đó, việc tiếp cận kỹ thuật hiệnđại c òn giúp hoàn thi ện các quy tr ình công ngh ệ khác trong các nghi ên c ứu xa nhưt ạo d òng, sinh thi ết, tạo động vật chuyển gen, bảo tồn động vật quý hiếm…VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG P HÁP Chu ẩn bị trứn g: Tr ứng b ò t ươi thu nhận tại l ò m ổ hay trứng đông lạnh đ ượcl ựa chọn, phân loại A, B. Các trứng n ày được nuôi trưởng thành trong môi trư ờngTCM 199 (Sigma) v ới 20% FBS (In vitrogen). Sau 24 giờ nuôi, tiến h ành phá l ớpt ế b ào cumulus bao quanh tr ứng bằng e nzyme hyaluronidase (1mg/ml, Sigma).338 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 (a) (b) Hình 1. Trứng bò chín. (a) Trước khi phá lớp cumulus, (b) Sau khi phá lớp cumulusChuẩn bị tinh tr ùng: Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ được giải đông ở 37 oC trong60 giây. Th ực hiện swim -up 15 phút trong môi t rường BO, thu nhận dịch nổi, chọn tinhtrùng cho vi tiêm. Hình 2. Vi tiêm tinh trùng vào bào t ương tr ứng Vi tiêm: Hút tinh trùng b ằng kim tiêm (injection pipette) trong gi ọt PVP (Invitrogen) chuy ển qua giọt TCM 199 chứa trứng. Kim giữ (holding pipette) trứng đ ượcđiều chỉnh thể cực ở vị trí 6 giờ hay 12 giờ, tiến h ành tiêm tinh trùng vào bào tươngtrứng một cách nhẹ nh àng, nhanh chóng v ới thể tích đưa vào bào tương trứng ít nhất. 339Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT Chuyển trứng sau khi vi tiêm vào môi trường nuôi phôi CR1aa. Sau 4 giờ nuôi, tiếnhành ho ạt hoá trứ ng sau khi vi tiêm v ới TCM 199 với 7% ethanol trong 4 phút. Tiếp tụcnuôi phôi trong môi trường CR1aa v à theo dõi các giai đoạn phát triển của phôi.KẾT QUẢ V À THẢO LUẬN Sau 9 lần vi tiêm, được 44 trứng, số phôi thu đ ược là 20 phôi, chi ếm tỷ lệ tạo phôilà 47,17%. Trong 20 phôi có 2 phôi ở giai đoạn 2 tế bào (10%), 5 phôi giai đo ạn 4 tếbào (25%), 10 phôi giai đo ạn 8 tế bào (50%), 1 phôi giai đo ạn 16 tế b ào (5 %) và 2 phôigiai đoạn morula (10%). (a) (b) (c) (d) Hình 3. Kết quả tạo phôi bò bằng ICSI. (a) Phôi 2 t ế bào, (b) Phôi 4 t ế bào, (c) Phôi 8 t ế bào, (d) Phôi morula Năm 1989, Younis và cs đ ã tạo được phôi b ò bằng kỹ thuật ICSI truyền thống v àtrứng không hoạt hóa với tỷ lệ 2%. Li v à cs (1999) t ạo phôi bằng piezo -ICSI có ho ạthóa bằng ethanol 7% phôi tạo ra với tỷ lệ 26,4%. Cùng năm đó Hamano đ ã thành côngvới tỷ lệ tương đối cao là 56,6 %. Năm 2004, Kato, H., Matsumoto và cs đ ã so sánhgiữa hoạt hóa bằng ethanol 7% v à không ho ạt hóa, đạt tỷ lệ phôi l à 51% so v ới khônghoạt hóa l à 13%. Takenaka và cs (2005) cùng dù ng phương pháp hoạt hóa bằng ethanol7% với tỷ lệ tạo phôi l à 75,6%.340 Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007 Như vậy với tỷ lệ tạo phôi là 47,17 % là tư ...