Bước đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện thịt heo và thịt bò trong thực phẩm dựa trên gen Cytochrome - B

Kỹ thuật PCR ngày càng được sử dụng phổ biến trong những nghiên cứu về phát hiện các loại mô động vật bằng phản ứng khuếch đại những trình tự DNA mong muốn. Ứng dụng phương pháp PCR, bước đầu chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân biệt thịt heo và thịt bò bằng kỹ thuật multiplex PCR (m-PCR) dựa trên sự khuếch đại gen Cytochrome - B bằng các cặp mồi đặc hiệu.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Bước đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện thịt heo và thịt bò trong thực phẩm dựa trên gen Cytochrome - BKỷ yếu hội thảo khoa học – Phân ban công nghệ thực phẩm BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN THỊT HEO VÀ THỊT BÒ TRONG THỰC PHẨM DỰA TRÊN GEN CYTOCHROME - B Nguyễn Thị Kim Oanh1, Lê Khánh Linh1, Nguyễn Thị Phương Thảo1, Nguyễn Thị Nết1,*1 Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh *Email: netnguyen1120@gmail.com Ngày nhận bài: 15/6/2017; Ngày chấp nhận đăng: 2/7/2017 TÓM TẮT Kỹ thuật PCR ngày càng được sử dụng phổ biến trong những nghiên cứu về phát hiện cácloại mô động vật bằng phản ứng khuếch đại những trình tự DNA mong muốn. Ứng dụng phươngpháp PCR, bước đầu chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân biệt thịt heovà thịt bò bằng kỹ thuật multiplex PCR (m-PCR) dựa trên sự khuếch đại gen Cytochrome - Bbằng các cặp mồi đặc hiệu. Các thông số tối ưu cho quy trình gồm: nhiệt độ bắt cặp giữa các cặpmồi và DNA khuôn trong quy trình khuếch đại DNA để phân biệt thịt heo và thịt bò bằng m-PCR là 59ºC, nồ ng đô ̣ tối ưu của từng cặp mồ i là 0,4µM và độ nhạy của phương pháp là0,1ng/µl. Chúng tôi đã ứng dụng quy trình m-PCRtrên 12 mẫu đồ hộp thịt bò được dán nhãnkhông có thịt heo. Kết quả qúa trình khảo sát ghi nhận có 4 mẫu đồ hộp có thành phần thịt heo(33,33%), 8 mẫu còn lại không có thành phần thịt heo (66,67%). Vì vậy, quy trình này có đủ cơsở khoa học để triển khai trên một số loại thực phẩm được chế biến từ thịt bò khác, với lượngmẫu lớn hơn.Từ khóa: multiplex PCR, phát hiện, thịt heo, thịt bò, Cytochrome - B. 1. GIỚI THIỆU Xác định loài của các động vật trong các sản phẩm thịt là một vấn đề quan trọng trong việcbảo vệ người tiêu dùng khỏi sự pha trộn bất hợp pháp hoặc không mong muốn, vì những lý dokinh tế, tôn giáo và y tế [1]. Vì thế, việc phát triển và ứng dụng các phương pháp phát hiệnnhanh và chính xác các loại thịt trong sản phẩm chế biến từ thịt gia súc, gia cầm là cần thiết [2].Sản phẩm thịt chế biến thường có nguồn gốc từ một hay nhiều loại thịt khác nhau. Do sự đadạng về hình thức, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt chế biến đã gây ra vấn đề gianlận thương mại. Trên thị trường có nhiều sản phẩm thịt thành phần trên nhãn hiệu, công thức chếbiến lệch với thực tế nhằm nâng cao giá trị cho sản phẩm. Đặc biệt, sự gian lận này có thể ảnhhưởng đến việc kiêng sử dụng một hay một vài loại thịt nào đó vì lý do sức khỏe (ví dụ bị dịứng) hay vì lý do tôn giáo (ví dụ, đạo Hindu không ăn thịt bò, đạo Hồi và đạo Do Thái không ănthịt heo) [2]. Những đổi mới gần đây trong công nghệ đóng gói sản phẩm đã làm cho việc xác 268 Nguyễn Thị Kim Oanh, Lê Khánh Linh, Nguyễn Thị Nết, Nguyễn Thị Phương Thảođịnh các thành phần thực phẩm dựa trên các thuộc tính vật lý rất khó hoặc không thể xác địnhđược [3], [4]. Các kế hoạch xác định thịt hiện có sẵn dựa trên công thức sinh học lipid, proteinvà nucleic acid [5]. Các phương pháp phát hiện dựa vào protein hoặc chậm hoặc không thể ứngdụng cho các sản phẩm thịt đã xử lý nhiệt, protein sinh học rất dễ biến đổi dưới những tác độngmạnh của các yếu tố hóa lý và cả loại và lượng chất béo (lipid biomarkers) có thể được thay đổitrong quá trình chế biến thực phẩm [6], [7]. Mặt khác, DNA sinh học là sự ổn định theo các điềukiện khác nhau, do đó các phương pháp dựa vào DNA thường được sử dụng hơn, đặc biệt là cácphương pháp PCR đặc trưng cho loài [6], [8]. Trong đó, các phương pháp Realtime PCR, PCR –RFLP, PCR sequencing, PCR – SSCP đòi hỏi máy móc, trang thiết bị, hóa chất phức tạp, giáthành cao, còn phương pháp m-PCR dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi trong việc phân biệtloài của thịt [6]. Trong phương pháp m-PCR, các trình tự gen Cytochrome-B được sử dụng rộngrãi trong các nghiên cứu về phát hiện loài, về khoa học pháp y và kiểm tra thực phẩm. Đây làmột trong những khu vực gen được bảo tồn chứa thông tin cụ thể về loài và là một gen chứcnăng nằm giữa các gen chịu trách nhiệm sản sinh ra tRNAGlu và tRNAThr mã hóa một phầnenzyme Cytochrome – C xúc tác cho phản ứng oxi hóa khử, cũng là một enzyme phức hợp trongquá trình phosphoryl oxy hóa [9]. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Hóa chất Hóa chất dùng chotách chiết DNA, phương pháp PCR và điện di được cung cấp bởi công tyTop Biotechnology Research (TBR).2.2. Mồi trong phản ứng khuếch đại PCR Các cặp mồi nhân bản DNA bò và heo được tham khảo từ các nghiên cứu trước đây. Mộtcặp mồi chung F và R dùng để phát hiện các loại thịt có nguồn gốc động vật, hai mồi P R và CRđặc hiệu cho thịt heo và bò tương ứng [10], [11]. Chi tiết về trình ...