Các kỹ thuật phân tích protein

Các kỹ thuật phân tích protein1. Chuẩn bị dịch chiết tế bào để tinh sạch protein Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong một số trường hợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứunày thường dẫn đến những kết luận “mù mờ”. Chẳng hạn như khi chúng ta nghiên cứu về hoạt tính của một enzym ADN polymerase trong một hỗn hợp...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Các kỹ thuật phân tích protein Các kỹ thuật phân tích protein1. Chuẩn bị dịch chiết tế bào để tinh sạchproteinViệc phân lập và tinh sạch được các loạiprotein riêng rẽ có ý nghĩa quyết địnhđến khả năng tìm hiểu được chức năngcủa chúng. Mặc dù trong một số trườnghợp, chúng ta có thể nghiên cứu chứcnăng của protein ở dạng hỗn hợp phứctạp, nhưng phần lớn những nghiên cứunày thường dẫn đến những kết luận “mùmờ”.Chẳng hạn như khi chúng ta nghiên cứuvề hoạt tính của một enzym ADNpolymerase trong một hỗn hợp proteinthô (chẳng hạn từ dịch phân giải tế bào),các enzym ADN polymerase và proteinthành phần khác cũng có thể ảnh hưởngđến hiệu suất tổng hợp ADN quan sátđược trong thực nghiệm. Vì vậy, việctinh sạch các protein là một bước quantrong trong quá trình tìm hiểu về chứcnăng của chúng.Mỗi một protein thường có một số đặctính riêng làm việc tinh sạch chúngthường có tính đặc thù. Điều này thì tráingược với ADN, vốn cơ bản giống nhauvề cấu trúc và thành phần, chỉ khác nhauvề trình tự của các nucleotit. Các bướctinh sạch từng loại protein thường dựatrên các đặc tính đặc thù của nó về kíchthước, hình dạng, điện tích và nhiều khilà chức năng của chúng.Vật liệu khởi đầu cho hầu hết các quátrình tinh sạch protein từ sinh vật là cácdịch chiết tế bào. Không giống ADN vốncó tính phục hồi cao trong các điều kiệnnhiệt độ sống khác nhau, thì protein rấtdễ bị biến tính và phá hủy sau khi bị giảiphóng ra khỏi tế bào. Vì lý do này, hầuhết quá trình chuẩn bị các dịch chiết vàtinh sạch protein được tiến hành ở nhiệtđộ lạnh (4oC). Có một số cách chuẩn bịdịch chiết tế bào. Các tế bào có thể phângiải bằng sử dụng chất tẩy, các lực làmvỡ thành tế bào, xử lý với dung dịchnhược trương (làm tế bào trương lên donước đi vào và vỡ ra), hoặc thay đổi độtngột áp suất. Điểm chung của tất cả cácphương pháp là làm thành tế bào vỡ ra vàcác protein được giải phóng. Trong mộtsố trường hợp, các tế bào được chuyển vềtrạng thái đông lạnh trước khi đượcnghiền bằng những máy nghiền mẫutrong phòng thí nghiệm.2. Sử dụng sắc ký cột trong tinh chếproteinPhương pháp chiết xuất và tinh sạchprotein phổ biến nhất là sắc ký cột. Trongtrường hợp này, các phân đoạn proteinđược cho chạy qua cột nhồi bằng các hạtagarose hoặc polyacrylamit nhỏ được cảibiến cho phù hợp. Có một số phương ánkhác nhau trong việc sử dụng cột táchchiết và tinh sạch protein. Các quy trìnhkhác nhau được thiết lập có thể khácnhau do đặc tính khác nhau của các loạiprotein. Ở đây mô tả ba phương pháp.Trong hai phương pháp đầu, proteinđược phân lập dựa vào kích thước và tínhtích điện của chúng. Tóm tắt về cácphương pháp này được nêu trên hình 14.Sắc ký trao đổi ion: Trong phương phápnày, các phân tử protein được phân lậpdựa trên điện tích ion hóa bề mặt củachúng bằng việc sử dụng các vật liệu làmcột là các hạt mang các nhóm chức tíchđiện âm hoặc dương (đây còn được gọi làpha tĩnh). Các phân tử protein tương tácyếu với các hạt (chẳng hạn như một phântử protein tích điện dương được cho chạyqua cột mang các hạt tích điện âm) sẽđược hồi lưu khi sử dụng một dung dịchmuỗi loãng chảy qua cột sau đó (dungdịch chạy mẫu được gọi là pha động).Các phân tử tương tác với pha động càngmạnh, càng cần dung dịch hàm lượngmuối cao để hồi lưu mẫu (bởi muối làmtrung hòa các vùng mang điện tích vàvì vậy cho phép các phân tử protein đượcgiải phóng khỏi cột. Bằng việc tăng dầnnồng độ muối trong các dung dịch đệmthu hồi mẫu, các phân tử protein khácnhau, kể cả các phân tử có đặc tính tíchđiện gần giống nhau cũng được phân táchthành các phân đoạn khác nhau khichúng được hồi lưu từ cột.Sắc ký lọc gel: Kỹ thuật này cho phépphân tách các loại protein trên cở sở đặcđiểm khác nhau của các loạiprotein về hình dạng và kích thước. Khácvới trong kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, cáchạt được sử dụng để nhồi cột trong kỹthuật này không mang các nhóm tíchđiện mà thay vào đó là mang các lỗ cókích thước khác nhau. Các phân tửprotein càng nhỏ càng có nhiều khả năngthâm nhập vào tất cả các lỗ; vì vậy, thờigian chạy qua cột dài hơn và thời gianhồi lưu muộn hơn. Ngược lại, các phântử protein kích thước càng lớn càng cóthời gian hồi lưu (chạy qua toàn bộ cột)sớm hơn.Đối với mỗi loại cột, các phân đoạn sắcký được thu ở các nồng độ muối khácnhau hoặc ở các thời gian hồi lưu khácnhau để thu được từng loại protein đượcquan tâm nghiên cứu. Các phân đoạn cóhoạt tính protein được quan tâm cao nhấtsẽ được tích lũy và tiến hành tinh sạch bổsung.Độ tinh sạch của sản phẩm protein sẽtăng lên khi các phân đoạn protein đượcchạy qua nhiều cột sắc ký khác nhau.Thông thường một cột sắc ký đơn lẻkhông đủ để tinh sạch được một loạiphân tử protein mong muốn nào đó dùquá trình sắc ký được lặp đi lặp lại nhiềulần, thay vào đó người ta thường phải ápdụng một chuỗi các bước kỹ thuật để cóthể thu được một phân đoạn chứa mộtlượng lớn loại protein cần quan tâmnghiên cứu. Chẳng hạn như, dù có rấtnhiều phân tử protein được hồi lưu trongdung dịch muối đậm đặc từ cột tích điệndương (đối với protein tích điện âm)hoặc được hồi lưu trong sắc ký lọc gel(đối với các protein kích thước tương đốinhỏ), các kỹ thuật này đơn lẻ thườngkhông đủ để thu được một sản phẩmprotein được tinh sạch hoàn toàn.3. Sắc ký ái lực hỗ trợ quá trình tinh chếproteinCác đặc tính đặc trưng của từng loạiprotein có thể được tận dụng để giúp tinhsạch loại protein tương ứng được thuậntiện và hiệu quả hơn. Giả sử, nếu chúngta biết một loại protein khi hoạt động liênkết đặc hiệu với ATP, thì có thể dùng cộtsắc ký mang vật liệu gắn kết ATP đểphân tách protein đó. Chỉ có protein liênkết với ATP mới được cột giữ lại, và chophép hầu hết các loại protein không liênkết với ATP được chảy trôi qua cột. Kỹthuật tinh sạch này được gọi là sắc ký áilực. Có nhiều hợp chất khác nhau ...