Các phương pháp lai phân tử và mẫu dò

Các phương pháp lai phân tử và mẫu dòCác phân tử ADN sợi kép có một tính chất đặc biệt là khả năng biến tính (phân tách thành hai mạch đơn) và hồi tính (hai mạch đơn có trình tự bổ trợ có xu hướng liên kết trở lại khi vắng mặt các tác nhân gây biến tính).
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Các phương pháp lai phân tử và mẫu dò Các phương pháp lai phân tử và mẫu dòCác phân tử ADN sợi kép có một tínhchất đặc biệt là khả năng biến tính (phântách thành hai mạch đơn) và hồi tính (haimạch đơn có trình tự bổ trợ có xu hướngliên kết trở lại khi vắng mặt các tác nhângây biến tính). Khả năng liên kết bổ trợgiữa các bazơ nitơ cũng cho phép haimạch ADN có nguồn gốc khác nhaunhưng có trình tự bổ trợ liên kết với nhautrong điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, độpH, ion hóa P) để tạo nên một phân tửADN mới.Hiện tượng liên kết như vậy cũng có thểxảy ra giữa hai mạch ADN với nhau,hoặc giữa hai mạch ARN hoặc giữaADN và ARN. Phân tử axit nucleic sợikép mới hình thành được gọi là phân tửlai và quá trình kết cặp giữa các bazơthuộc hai mạch đơn axit nucleic cónguồn gốc khác nhau theo nguyên tắc bổtrợ như vậy được gọi là quá trình lai phântử.Nhiều kỹ thuật trong nghiên cứu ditruyền phân tử được dựa trên nguyên tắclai phân tử. Chẳng hạn, bằng nguyên tắcnày người ta có thể dùng một trình tựADN biết trước để xác định một trình tựbổ trợ tương ứng có trong hệ gen củamẫu phân tích. Phân đoạn ADN có trìnhtự biết trước dùng trong phản ứng lai nhưvậy được gọi là mẫu dò. Các mẫu dò cóthể có nguồn gốc từ các phân đoạn ADNtrong tự nhiên hoặc được tổng hợp theonguyên tắc hóa học, và để nhận biết đượcchúng, các mẫu dò thường được đánhdấu với các chất phóng xạ hoặc pháthuỳnh quang (ở đây, gọi tắt là chất phátquang).Có hai phương pháp đánh dấu mẫu dòADN. Phương pháp thứ nhất dùngnguyên tắc tổng hợp hóa học phân tửADN mới với tiền chất là các phân tửđánh dấu. Phương pháp thứ hai là gắnmột phân tử đánh dấu vào đuôi của mộttrình tự ADN có sẵn. Chẳng hạn, bằngviệc sử dụng enzym polynucleotidekinase, người ta có thể bổ sung nhómphosphat g của ATP vào nhóm 5’- OHcủa một phân tử ADN định đánh dấu.Nếu nhóm phosphat này được đánh dấubằng đồng vị phóng xạ 32P thì phân tửADN sẽ được dánh dấu phóng xạ.Phương pháp đánh dấu ADN thứ hai (sửdụng các tiền chất đánh dấu) thườngđược thực hiện dựa trên phản ứng PCR,hoặc đôi khi chỉ cần sử dụng các đoạnmồi ngắn rồi cho enzym ADNpolymerase thực hiện phản ứng kéo dàichuỗi. Các tiền chất đánh dấu được sửdụng thường là 1 trong 4 loại nucleotitđược cải biến thành dạng được đánh dấubằng cách gắn với các nhóm chất phátquang hoặc nguyên tử phóng xạ. Vớiphương pháp này, khoảng 25% nucleotittrong phân tử ADN được đánh dấu vàđiều đó đủ đáp ứng hầu hết các nhu cầunghiên cứu khác nhau.Các phân tử ADN đánh dấu với các tiềnchất phát quang được phát hiện bằngcách chiếu xạ mẫu ADN với ánh sángUV có bước sóng phù hợp và đo ở bướcsóng phát xạ tương ứng. Các phân tửADN được đánh dấu phóng xạ thườngđược phát hiện bằng cách chụp mẫuADN với phim tia X, hoặc đo bằng máykhuếch đại tín hiệu hạt b từ các nguyêntố phóng xạ 32P và 35S (đây là hainguyên tố phóng xạ được sử dụng phổbiến để dánh dấu ADN).Trong các nghiên cứu di truyền học phântử hiện nay, có nhiều cách để xác địnhcác phân đoạn ADN và ARN đặc hiệudựa trên các phương pháp lai. Ở đây,chúng ta chỉ đề cập đến hai phương phápđược dùng phổ biến:Xác định các phân đoạn ADN và ARNbằng điện di và mẫu dòPhương pháp sử dụng mẫu dò kết hợpvới điện di là một phương pháp cơ bản cóthể giúp xác định mức độ phổ biến hoặckích thước của một đoạn trình tự ADNhoăc ARN được quan tâm nghiên cứu.Chẳng hạn như bằng kỹ thuật này, ngườita có thể xác định và so sánh được mứcbiểu hiện của một gen ở các loại tế bàovà mô khác nhau thông qua định lượngbản phiên mã mARN tương ứng của genđó tại các tế bào và mô tương ứng; haynhư để xác định kích thước của một đoạnADN cắt giới hạn mang trình tự genđược quan tâm nghiên cứu.Giả sử chúng ta cắt hệ gen của nấm menbằng enzym giới hạn EcoRI và cần xácđịnh được kích thước của phân đoạnADN cắt giới hạn mang trình gen A. Sảnphẩm ADN tổng số sau khi được cắtbằng EcoRI sẽ tạo ra một số lượng lớncác phân đoạn có kích thước xấp xỉ 4 kb(vì 46 = 4096 bp). Vì vậy, nếu đem sảnphẩm cắt giới hạn nhuộm vớiEtBr, thì sản phẩm điện di sẽ là một dảicác phân đoạn liên tục có kích thước xấpxỉ 4 kb, và không thể xác định đượcchính xác phân đoạn nào mang gen A.Trong trường hợp đó, kỹ thuật thẩm táchSouthern (còn gọi là lai Southern) có thểđược dùng để xác định phân đoạn manggen đó. Lúc này, người ta sẽ đem sảnphẩm cắt giới hạn ngâm vào một dungdịch có tính kiềm để làm biến tính cácphân đoạn ADN sợi kép. Các phân đoạnnày sau đó được chuyển sang một màngtích điện dương gọi là màng “thẩm tách”theo hình thức “đóng dấu”. Nghĩa là cácphân đoạn ADN định vị trên màng thẩmtách sẽ tương ứng với các phân đoạn địnhvị trên gel điện di. Các phân đoạn ADNgắn trên màng thẩm tách sau đó được ủvới mẫu dò là phân đoạn ADN chứa mộtđoạn trình tự đặc trưng bổ trợ với trình tựcủa gen A. Quá trình ủ được tiến hànhtrong điều kiện về nhiệt độ và nồng độmuối tương ứng với sự biến tính và hồitính của axit nucleic. Trong điều kiện đó,các mẫu dò sẽ chỉ lai đặc hiệu với phânđoạn ADN mang gen A. Do các phânđoạn gen có kích thước thường lớn hơnnhiều so với mẫu dò, nên khả năng hồitính khó xảy ra hơn khả năng lai với mẫudò. Sau đó, nhờ phương pháp phóng xạtự chụp (mẫu dò được đánh dấu phóngxạ), các phân đoạn ADN bắt cặp với cácmẫu dò có thể được xác định và phân lậprõ ràng. Các phân đoạn này chính là cácphân đoạn mang trình tự gen A cần phântích.Một phương pháp tương tự như vậy cũngcó thể được áp dụng trực tiếp để phântích các sản phẩm phiên mã của gen làmARN, và được gọi là phương phápthẩm tách Northern (lai Northern). Tuyvậy, vì so với ADN các phân tử mARNthường có kích thước ngắn hơn (khoảng5 kb), nên trong thẩm tách Northern, cácphân tử mARN không cần cắt bằngenzym giới hạn (nếu có cắt thì số vị trícắt giới hạn của một enzym trên phân tửmARN thường thấp). Các phân tửmARN sau khi phân tách bằng điện di ...