Các phương pháp phân tích ADN

Được phát triển bởi Pål Nyrén và Mostafa Ronaghi tại Royal Institute of Technology, Thụy Điển, năm 1996Dựa vào phát hiện sự phóng thích pyrophosphate khi nucleotide được gắn vàoThành phần phản ứng:ADN sợi đơn Mồi Các enzym: DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase, Các cơ chất adenosine 5´ phosphosulfate (APS) và luciferin
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Các phương pháp phân tích ADNCacphươngphap ́ ́ phântichADN ́ PGS.TS.TrầnCátĐông Chiêttachvâtliêuditruyên ́ ́ ̣ ̣ ̀  Nguyêntăcchung:3bươc ́ ́ – Phavơtêbao:vâtly,hoahoc ́ ̃ ́ ̀ ̣ ́ ́ ̣ – Chiêttachacidnucleic:PhenolChloroform ́ ́ – Kêttuaacidnucleic:côntuyêtđôi ́ ̉ ̀ ̣ ́  Cactrươnghơpcuthê: ́ ̀ ̣ ̣ ̉ – Plasmid:muctiêuloaiNSTbăngsưkhacnhauvêcâudangkichthươc ̣ ̣ ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̣ ́ ́ – ADNthưckhuân:tuaphagebăngPEG,loaibocapsid ̣ ̉ ̉ ̀ ̣ ̉ – TêbaoThưcvât:phatêbaobăngcachnghiên ́ ̀ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̀ – TêbaoĐôngvât:phatêbaobăngenzymchâttây ́ ̀ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̉ – ARN:bâthoatRNase,tuabăngLiCl8M,loaiADNbăngDNase ́ ̣ ̉ ̀ ̣ ̀ – TualươngADNnho:đônbăngtARN ̉ ̣ ̉ ̣ ̀ – Tuabăngisopropanol,tertbutanol,… ̉ ̀  Cackythuâtkhac ́ ̃ ̣ ́ – Loaicarbohydrat,lipidbăngCTAB ̣ ̀ – ThuhôiADNbăngsăckyhâpphụ ̀ ̀ ́ ́ ́2 Tinhchêacidnucleic ́  Siêulytâm,lytâmphânđoan ̣ – Gradientliêntục/khôngliêntuccuacesiumchloride(CsCl) ̣ ̉ – Gradientsaccharose  Săcky ́ ́ – Sắckýáilực:sửdụngphatĩnhlàUSepharosehayoligodTcelluloseđể tinhchếmARN. – Sắckýlọcgelđểtáchcácnucleotidtựdosaukhitạomẫudòđánhdấu. – Sắckýtraođổiiontrênvicột,ápdụngđểthuhồinhữnglượngADNrất nhỏ. – Sắckýlỏnghiệunăngcao:dùngđểtinhchếcácoligonucletidtổnghợp (độphângiảilà1nucleotid),plasmid,phântáchcácđoạnADN.  Điêndi: ̣ – Agarose – PAGE(PolyAcrylamideGelElectrophoresis)3 Đinhtinhđinhlươngacidnucleic ̣ ́ ̣ ̣  Quangphôkê:OD260nm ̉ ́ – 50μg/mldungdịchADN(hoặcARN)sợiđôi – 40μg/mldungdịchARN(hoặcADN)sợiđơn – 30μg/mloligonucleotid(tới70base) – KiêmtrađôtinhkhiêtbăngtylêOD260/230hoăcOD260/280, ̉ ̣ ́ ̀ ̉ ̣ ̣ OD320nm  Điêndigel:phântachacidnucleicbăngdongđiên ̣ ́ ̀ ̀ ̣ tronggel – Đinhtinhtheokichthươc ̣ ́ ́ ́ – Đinhlươngbăngsosanhvơichuân ̣ ̣ ̀ ́ ́ ̉4 Điêndi ̣5 Cácenzymbiếnđổiacidnucleic  Enzymcắthạnchế/methylase – CắtADNtạivịtríxácđịnh – Tạorađầudínhhoặcđầutù – Lưuýtínhtươngthíchkhicắtnối  Polymerase – ADNpolymerasephụthuộcADN – PolymerasephụthuộcARN(hoặcADN) – ADNPolymerasekhôngphụthuộckhuônmẫu – ARNpolymerasephụthuộcADN  Ligase – NốihaiđoạnADN Nôiđươc ́ ̣ Nôiđươc ́ ̣ Khôngđươc ̣6 Kythuâtlaiacidnucleic ̃ ̣  Lasưbătcăpbôsungđăchiêucuahaiphântưacid ̀ ̣ ́ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ nucleicmachđơn ̣ G-T-A-G-T-C-C + T-C-A-G-G-T G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T  Cacyêutôanhhương ́ ́ ́ ̉ ̉ – NồngđộADNvàthờigianphảnứng – Nhiệtđộ – Độdàicủacáctrìnhtự – Lựcion7 Kythuâtlaiacidnucleic ̃ ̣  SouthernBlot:laiADN Chiết tách ADN vi khuẩn NorthernBlot:laiARN Gắn ADN vào màng  ADN đích Màng  Laitaichỗ(insitu ...