Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật Sinh học phân tử

Bệnh sốt rét là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Hằng năm, căn bệnh này cướp đi sinh mạng của hàng triệu người trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P.malarie, P. ovale) với trung gian truyền bệnh là muỗi cái Anopheles (hay còn gọi là muỗi đòn xóc). Các triệu chứng điển hình của bệnh là sốt, đau đầu, nôn… Nếu không điều trị kịp thời hoặc ký sinh trùng kháng lại thuốc có thể dẫn đến...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật Sinh học phân tử Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật Sinh học phân tửBệnh sốt rét là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Hằng năm,căn bệnh này cướp đi sinh mạng của hàng triệu người trên thế giới, đặc biệt là ởnhững nước đang phát triển.Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P.malarie, P.ovale) với trung gian truyền bệnh là muỗi cái Anopheles (hay còn gọi là muỗi đònxóc). Các triệu chứng điển hình của bệnh là sốt, đau đầu, nôn… Nếu không điềutrị kịp thời hoặc ký sinh trùng kháng lại thuốc có thể dẫn đến tử vong do ký sinhtrùng xâm nhập, phá vỡ hồng cầu làm tắc nghẽn các mạch máu.Bên cạnh các phương pháp truyền thống được sử dụng để xét nghiệm phát hiện 4loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh trên người như: nhuộm giemsa, QBC, ELISA,Paracheck…Các kỹ thuật dựa trên nguyên lý của phương pháp PCR (Polymerasechain reaction) như: Nested -PCR, Real-time PCR, LAMP đang được sử dụng rộngrãi trong chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét.1/ Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction):Phương pháp PCR có khả năng tạo ra hàng triệu bản sao của trình tự gen mục tiêuthông qua hoạt động sao chép tổng hợp mạch mới của enzyme DNA polymerasetrong điều kiện in vitro với sự hiện diện của các cặp mồi chuyên biệt.Hiện nay, trên thị trường đã có bộ máy luân nhiệt sử dụng cho thực địa. Điều n àykhắc phục được điểm yếu của phương pháp PCR là cần phòng thí nghiệm với cácmáy móc chuyên dụng khá phức tạp.Bộ trang thiết bị thí nghiệm PCR sử dụng ở thực địa2/ Phương pháp Nested PCR:Trong phương pháp Nested PCR (PCR lồng), sản phẩm của phản ứng PCR lần 1sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Nested PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu đểnhân bản bộ gen của loài Plasmodium trong phản ứng PCR lần 1. Sau đó tiếp tụcsử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovaletrong phản ứng PCR lần 2. Kỹ thuật n ày có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện kýsinh trùng ở mật độ rất thấp mà các phương pháp thông thường khó có thể pháthiện được (1-5 ký sinh trùng/1 µl máu). Đây được xem là “tiêu chuẩn vàng” mớitrong tầm soát ký sinh trùng sốt rét do độ nhạy và độ đặc hiệu cao của nó.Kết quả chạy điện di phát hiện P. vivax và P. falciparum với các mật độký sinh trùng khác nhau trong phương pháp Nested PCR3/ Phương pháp Real-Time PCR:Real-Time PCR có cùng nguyên lý với phương pháp PCR, cũng là một phản ứngnhân bản các trình tự đặc hiệu nhưng có sử dụng chất phát huỳnh quang. Việc pháthiện tín hiệu huỳnh quang được thực hiện ngay trong bước bắt cặp mồi và kéo dài.Nhờ đó, phương pháp này vừa có thể phát hiện vừa có thể định lượng ký sinhtrùng trong mẫu xét nghiệm theo thời gian thực dựa trên mẫu dò.Có 2 dạng cơ bản:- Chất phát huỳnh quang liên kết với DNA mạch đôi (SYBR Green, Ethidiumbromide)Nguyên lý Real-Time PCR với SYBR Green- Chất phát hu ỳnh quang dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (TaqMan probe, Beaconmolecular, Hydrolysis probe, Hybridization probe,…)Nguyên lý Real-Time PCR với Taqman probe4/ Phương pháp LAMP (Loop-Mediated Isothermal PCR):Đây là một phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử mới, đ ơn giản, rẻ tiền dùngđể xác định trình tự gen 18S ribosom RNA của P. falciparum. Phương pháp nàykhông cần các máy móc đắt tiền như PCR, nhiệt độ thực hiện cũng thấp hơn(khoảng 65oC), thời gian thực hiện ngắn, chỉ bằng 1/3 so với phương pháp PCRvà có hiệu quả tương tự. Tuy nhiên, phương pháp này tương đối mới, các Primersử dụng phức tạp và cần có những nghiên cứu nhiều hơn trước khi áp dụng vàoviệc chẩn đoán thường quy 4 loài ký sinh trùng sốt rét.Phương pháp LAMPƯu điểm của các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử là có thể định danh vàđịnh lượng ký sinh trùng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đặc biệt thích hợp chonhững ca nhiễm ký sinh trùng ở mật độ thấp hoặc nhiễm phối hợp nhiều loài.Tuy nhiên, hiện nay, kỹ thuật PCR vẫn chưa thể thay thế kỹ thuật xét nghiệm bằngkính hiển vi trong chẩn đoán thường quy do quy trình thực hiện còn phức tạp, cầncó trang thiết bị chuyên biệt, phòng thí nghiệm phù hợp, hóa chất đắt tiền, kỹ thuậtviên phải được đào tạo và huấn luyện… Mặc dù vậy, với sự phát triển mạnh mẽcủa khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng các kỹ thuật cao trong nghiên cứu sẽ đóngmột vai trò quan trọng trong công tác phòng chống bệnh sốt rét. ...