CHỈ THỊ NỘI ĐỘC TỐ

CHỈ THỊ NỘI ĐỘC TỐ Mục đích sử dụng: Chỉ thị nội độc tố được thiết kế cho việc thẩm định hoặc theo dõi quá trình loại chất gây sốt (pyrogen) như quá trình tiệt trùng bằng sấy khô và các phương pháp rửa. Sự đánh giá của quá trình loại nội độc tố có thể đo được bằng việc so sánh nồng độ của endotoxin trước và sau chu trình loại nội độc tố, bằng cách sử dụng hóa chất ....
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
CHỈ THỊ NỘI ĐỘC TỐ CHỈ THỊ NỘI ĐỘC TỐMục đích sử dụng:Chỉ thị nội độc tố được thiết kế cho việc thẩmđịnh hoặc theo dõi quá trình loại chất gây sốt(pyrogen) như quá trình tiệt trùng bằng sấykhô và các phương pháp rửa. Sự đánh giá củaquá trình loại nội độc tố có thể đo được bằngviệc so sánh nồng độ của endotoxin trước vàsau chu trình loại nội độc tố, bằng cách sửdụng hóa chất và thiết bị đo nội độc tổ củaCharles River. Dược điển Mỹ khuyến cáo rằngmột quá trình loại bỏ nội độc tố nên giảm mộtchỉ thị nội độc tố ít nhất 1000 lần (giảm 3 log)về hoạt tính khi được đo bằng phương phápLAL.Giải thích thí nghiệm .Phương pháp tiệt trùng bằng sấy khô làphương pháp hay được chọn hơn khi xử lý sảnphẩm thủy tinh và các nguyên liệu chịu nhiệtkhác để loại bỏ nội độc tố. Dược điển Mỹ,Mục số 7 về kỹ thuật đối với dược phẩmkhông uống, hiệp hội những người sử dụngLAL và những người khác đã cho thấy các kếtquả trong việc sử dụng chỉ thị nội độc tố.(1-6)Chỉ thị nội độc tố của Charles River đã đượcchuẩn bị cẩn thận và được thí nghiệm kỹlưỡng về thành phần nội độc tố, do đó hoạt lựcnội độc tố trong các ống chỉ thị nội độc tố cóthể đạt được với sự pha loãng 2 lần của hoạtlực được dán nhãn của lysate chuẩn thamchiếu. Mức độ cuả quá trình loại chất gây sốtcó thể được đánh giá bằng cách so sánh lượngnội độc tố của chỉ thị nội độc tố đã qua chutrình loại nội độc tố với chỉ thị nội độc tố chưaqua chu trình loại nội độc tố. Các hóa chất hayđược sử dụng cho việc đánh giá này là CharlesRiver endosafe 50 test 0.125 EU/ mL (code:R110). Phương pháp thuận tiện nhất cho việcđịnh lượng chỉ thị nội độc tố là sử dụngphương pháp Kinetic LAL và sử dụng các sảnphẩm KTA(code: R150), hóa chất định lượngtheo phương pháp kinetic turbidimetric hoặcEndochrom K (code:R170), hóa chất địnhlượng theo phương pháp kinetic chromogeniccủa Charles River.Thành phần:Mỗi lọ chưa 2000 EU (endotoxin Units)lipopolysaccharide từ E.coli 055:B5, đượcchứng nhận bởi Charles River Endosafe vớicác nguyên liệu tham chiếu. Ống chỉ thị đượclàm bằng thủy tinh cứng nhìn trống trơn vì nộiđộc tố đông khô không được trộn lẫn với cácchất phụ gia khác.Bảo quản: ở 25 o C với nắp chưa mở.Chú ý: chỉ thị nội độc tố chứa mộ lượng nhấtđịnh chất gây sốt, do đó chúng nên được chỉđịnh theo quy định thuốc tiêm. Các chỉ thị nộiđộc tố chỉ sử dụng ngoài cơ thể, không đượcsử dụng cho người hoặc động vật.Phương pháp:Phương pháp đặt chỉ thị nội độc tố. Đối vớithẩm định hầm sấy, lò sấy, đặt chỉ thị nội độctố ở nơi được chỉ định. Ngay trước khi đưa chỉthị nội độc tố vào nơi chỉ định, mở nắp ống,loại bỏ nắp cao su và thay thế bằng tấm nhômlá và đưa chỉ thị nội độc tố vào quá trình sấy.Ghi chú: nhãn của ống chỉ thị nội độc tố làchịu nhiệt nên không cần loại bỏ trước khi đưavào sấy.Chuẩn bị phân tích:Sau khi chỉ thị nội độc tố đã được sấy, Cácống mẫu đã qua quá trình sấy và một hoặc haichỉ thị nội độc tố đã qua sấy (chỉ thị dương)nên được chuẩn bị cho việc phân tích. Các chỉthị nội độc tố nên được đánh giá bởi mộtphương pháp LAL đã được thẩm định, độnhạy của hóa chất được đánh giá bởi chỉ thịnội độc tố chuẩn đã được chứng nhận (code:E110 hoăc E120) hoặc RSC (ReferenceStandard Endotoxin –nội độc tố tham chiếu ).Tất cả các ống nên được chuẩn bị cho kiểm traLAL bằng cách thêm 1 mL LRW (code:W110) và vortex 2 phút và sau đó là 1 phútsau mỗi 10 phút trong khoảng 1 giờ 30 phút.Phân tích LAL nên bắt đầu nhanh chóng để kếtquả được chính xác.Phương pháp phân tích bằng Gel-clot:Tính toán sự giảm nội độc tố bằng cách tìmnồng độ cuối của đối chứng dương (Chỉ thị nộiđộc tố qua quá trình sấy) bằng cách pha loãng10 lần và sau đó 2 lần và lấy log[E] (nồng độnội độc tố) chưa qua sấy trừ đi log[E] của chỉthị nội độc tố đã qua sấy. Sử dụng log[λ] chonồng độ endotoxin trong các ống qua sấy khikết quả kiểm tra LAL âm tính đối với dungdịch không pha loãng.Ví dụ:Giảm log = log 2000 EU/mL – log 0.125EU/mL= 3.301 – ( - 0.903)=4.2Do đó kết quả của quá trình loại chất gấy sốt(depyrogenation) được minh chứng ở trên làgiảm 4.2 log.Phương pháp phân tích bằng Kinetic LAL:Một phương pháp thuận tiện cho việc phântích chỉ thị nội độc tố là sử dụng phương phápkinetic LAL từ Charles River. Phương phápphân tích được thực hiện bằng việc thiết lậpmột phân tích kinetic chromogenic hoặckinetic turbidimetric sử dụng một đường congchuẩn 2 log 0.05 đến 5.0 EU và kiểm tra sựpha loãng của một đối chứng dương và cácmẫu không pha loãng. Kết quả của phân tíchthỏa mãn các điều kiện > giảm 3 log nếu log(đối chứng dương) – log (đối chứng dương đãqua quá trình sấy) > 3.Ví dụ tính toán được đưa ra ở đây là đối chứngdương có nồng độ ban đầu là 2000 EU/mL vàsau quá trình sấy là nhỏ hơn lamda (0.05EU/mL), điểm thấp nhất của đường congchuẩn.Giảm log = log 2000 EU/mL – log 0.05EU/mL=3.301 –(-1.301)=4.6Tài liệu tham khảo:1. U.S Pharmacopeia 23, United StatesPharmacopeial convention ...