Chương 10: Đại cương về Công nghệ DNA Tái tổ hợp

Việc tinh chế enzyme cắt giới hạn đầu tiên (1970) và sử dụng nó để tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên trong ống nghiệm (1972-1973) là nền tảng cho sự ra đời của kỹ thuật di truyền (genetic engineering) và công nghệ DNA tái tổ hợp (recombinant DNA technology). Chính sự phát triển nhanh chóng của lĩnh vực này không những đã đưa lại khối lượng tri thức khổng lồ về cấu trúc và cơ chế hoạt động của các gene, các bộ gene prokaryote và eukaryote mà còn trở thành lực lượng sản xuất...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 10:Đại cương về Công nghệ DNA Tái tổ hợp 258Chương 10Đại cương về Công nghệ DNA Tái tổ hợp Việc tinh chế enzyme cắt giới hạn đầu tiên (1970) và sử dụng nó đểtạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên trong ống nghiệm (1972-1973)là nền tảng cho sự ra đời của kỹ thuật di truyền (genetic engineering) vàcông nghệ DNA tái tổ hợp (recombinant DNA technology). Chính sự pháttriển nhanh chóng của lĩnh vực này không những đã đưa lại khối lượng trithức khổng lồ về cấu trúc và cơ chế hoạt động của các gene, các bộ geneprokaryote và eukaryote mà còn trở thành lực lượng sản xuất trực tiếp củaxã hội: tạo ra hàng loạt các chế phẩm y-sinh học hữu ích từ các tế bào vikhuẩn, nấm men; tạo các giống sinh vật mới... góp phần giải quyết nhữngvấn đề thực tiễn đặt ra trong y học và trong công tác chọn tạo giống. Trong chương này chúng ta sẽ tìm hiểu các đặc tính của enzyme cắtgiới hạn, các nguyên lý cơ bản của kỹ thuật DNA tái tổ hợp và một số ứngdụng của lĩnh vực công nghệ này.I. Các công cụ chính của kỹ thuật tạo dòng DNA tái tổ hợp1. Các enzyme cắt giới hạn1.1. Enzyme cắt giới hạn là gì? Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzymegiới hạn (restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tựnucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sungtại các vị trí đặc thù.1.2. Vai trò của các enzyme cắt giới hạn Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vikhuẩn E. coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA đượcđưa vào, gọi là DNA ngoại lai hay DNA lạ, mất hẳn hoạt tính di truyền vàhầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn. Chỉ trong một số íttrường hợp DNA lạ đó mới không bị phân cắt và do đó nó có thể tái bảntrong tế bào chủ. Điều đó chứng tỏ DNA lạ được sửa đổi bằng cách nào đódưới sự kiếm soát của tế bào chủ. Các hiện tượng nói trên xảy ra chủ yếukhi các thể thực khuẩn (phage) xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn. Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vikhuẩn là những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi vàcác enzyme cắt giới hạn. Chúng đều có đối tượng nhận biết là các đoạntrình tự của DNA vật chủ và DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau.Cụ thể, các enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ 259bằng cách gắn thêm nhóm methyl (-CH3) ở một số base nhất định trongđoạn nhận biết (recognition sequence) hay đoạn đích (target sequence).Hiện tượng methyl hoá (methylation) này thường xảy ra đối với adeninevà biến đổi nó thành N-6 methyladenine. Trong khi đó, các enzyme giớihạn lại đóng vai trò vô hiệu hoá hoạt tính di truyền của các DNA lạ bằngcách phân cắt ở các vị trí đặc thù chừng nào nó chưa được sửa đổi chogiống với DNA vật chủ. Như vậy, các enzyme giới hạn đóng vai trò làhàng rào bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm nhậpcủa các phage lạ.1.3. Tính chất chung của các enzyme giới hạn Trước tiên, cần lưu ý rằng các enzyme giới hạn chỉ phát hiện thấy ở cácvi khuẩn mà không có ở các eukaryote. Vì vậy, tên gọi của các enzymegiới hạn thông dụng là tên hệ thống, được biểu thị bằng ba hoặc bốn chữcái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme được chiết xuất. Chữ cái đầutiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái tiếp theo viết thườngđể chỉ loài (species), và khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư để chỉ nòi hoặcchủng (strain, type). Ngoài ra, để phân biệt các enzyme cùng một nòingười ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống (xem bảng 10.1). các đoạn DNA nối ở các đầu dính đầu dính đầu dính + DNA ligase DNA tái tổ hợpHình 10.1 Enzyme giới hạn (EcoRI) cắt các DNA khác nhau, nhờ đó có thểkiến tạo phân tử DNA tái tổ hợp in vitro (bắng enzyme DNA ligase). Tính chất quan trọng nhất của các enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vịtrí, nghĩa là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc thù để cắt ở vịtrí xác định. Tuỳ theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại: 260loại I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận biếtvà loại II bao gồm các enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết. Ởđây chúng ta chỉ xét các enzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụhiệu năng (giống như con dao mổ tinh vi) cho phép thao tác trên các genetrong kỹ thuật DNA tái tổ hợp (hình 10.1). Đặc trưng nổi bật của các đoạn đích là có kích thước ngắn, 4-8 cặpbase, và có tính đối xứng xuôi ngược (palindrome). Nhìn chung, các enzyme giới hạn khác nhau có hai kiểu cắt sau đây:cắt lệch và cắt thẳng. Với kiể ...