Chương 2: Điện di gel

Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch các đại phân tử-đặc biệt là các protein và các nucleic acid-trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 2: Điện di gel Chương 2 Điện di gelI. Nguyên lý chung Điện di là kỹ thuật được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch các đại phân tử-đặc biệt làcác protein và các nucleic acid-trên cơ sở kích thước/khối lượng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cựcdương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thựchoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, vàvì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương. Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix)như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose vàpolyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có cácgiếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điệnvà một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối.II. Điện di agarose gel Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da (Hình 2.1) là một trong haithành phần chính của agar1 chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%. Agarose làmột polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose. Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giống như agar,được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đóđược làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC. Agarose gel được ứng dụng rộng rãi để làm giá thểcho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang (horizontal electrophoresis) hoặc làm giá thể cho môitrường nuôi cấy bacteriophage (top agarose).Hình 2.1. Cấu trúc phân tử của agarose. Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử đường) là một monomer trongagarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên một chuỗi polymer. Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âmsang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Kỹ thuật này đơngiản và thực hiện nhanh. Hơn nữa, vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA tronggel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể pháthiện dưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet-UV). Điện di agarose gel được sử dụng trong các trường hợp sau: - Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lậpbản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…). - Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…). - Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khithẩm tích Northern. Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lýhơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi. Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trìnhđiện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel1.1. Kích thước của phân tử Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 củakhối lượng phân tử của chúng (Hình 2.2). Do đó, các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượngphân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm. Hình 2.2. Mối quan hệ giữa kích thước DNA và độ linh động điện di của nó1.2. Nồng độ agarose Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứacác nồng độ agarose khác nhau. Mối quan hệ tuyến tính giữa hàm logarithm của độ linh động điện di củaDNA (m) và nồng độ gel (t) được biểu diễn bằng biểu thức: Trong đó mo: độ linh động điện di tự do. Kr: hệ số trì hoãn điện di (retardation), được thiết lập thông qua mối liên quan giữa các tính chất của gel vớihình dạng và kích thước của các phân tử dịch chuyển. Như vậy, dùng gel ở các nồng độ khác nhau có thể phân tách được các đoạn DNA có kích thướckhác nhau (Bảng 2.1). Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA nhỏ, trong khi đó nồngđộ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn. Bảng 2.1. Các thông số điện di DNA bằng agarose gel Hình 2.3 minh họa sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong hai mẫu ở ba nồng độ khácnhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay gel và được điện di ở cùng một điện áp (voltage) trongmột thời gian xác định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong khi cácđoạn nhỏ thích hợp với gel 2%.Hình 2.3. Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5% và C: 2%.1.3. Cấu hình của DNA Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) có cùng một khốilượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau. Nhìn chung, DNA của các plasmidmạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hếtplasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêuxoắn) và vòng đứt. Hình 2.4 minh họa kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loạimạch thẳng ở bên phải. Hình 2.4. Điện di các plasmid có cấu hình khác nhau1.4. Thành phần base và nhiệt độ Tập tính điện di của DNA trong agarose gel không bị ảnh hưởng rõ rệt bởi thành phần base củaDNA hoặc nhiệt độ mà ở đó gel được chạy. Trong agarose gel, tính linh động điện di tương đối của cácđoạn DNA có kích thước khác nhau không thay đổi trong khoảng từ 4oC đến 30oC. Nói chung, agarosege ...