Chương 4: Các hệ thống vector

Có ba nhóm vector chính được sử dụng trong tạo dòng DNA và nhân bản chúng trong tế bào vật chủ (E. coli hoặc nấm men), bao gồm: 1) Nhóm plasmid, 2) Nhóm phage/phagemid, và 3) Nhóm nhiễm sắc thể nhân tạo (artificial chromosome: BAC và YAC). Ý tưởng về vector chuyển gen bắt nguồn từ các plasmid của vi khuẩn.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 4: Các hệ thống vector Chương 4 Các hệ thống vector Có ba nhóm vector chính được sử dụng trong tạo dòng DNA và nhân bản chúng trong tế bào vậtchủ (E. coli hoặc nấm men), bao gồm: 1) Nhóm plasmid, 2) Nhóm phage/phagemid, và 3) Nhóm nhiễmsắc thể nhân tạo (artificial chromosome: BAC và YAC). Ý tưởng về vector chuyển gen bắt nguồn từ cácplasmid của vi khuẩn. Vector chuyển gen là phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tếbào và mang được các gen cần chuyển. Các vector chuyển gen phải thỏa mãn các yêu cầu tối thiểu sau: - Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tự sao chép mà tồn tại độc lập. - Có các vị trí nhận biết đơn (single recognition sites-SRS), nơi mà các enzyme hạn chế nhận biết đểcắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu sao chép đểtránh bị cắt nhầm. - Có trình tự khởi động (promoter) để tiến hành phiên mã gen ngoại lai. - Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp ở dạng độc lập hay gắn vào nhiễm sắc thể củatế bào vật chủ. - Có các gen chỉ thị (marker genes) để dễ dàng phát hiện ra thể tái tổ hợp. Ngoài ra, chúng còn phải có những đặc tính bổ sung khác để cho việc tạo dòng dễ thực hiện như là: - Chứa các gen làm vô hiệu hóa đoạn DNA không mong muốn được gắn vào. - Có nhiều bản sao để được tách ra khỏi tế bào với số lượng lớn và đảm bảo sự khuếch đại của genngoại lai. - Ngoài promoter cần có thêm các trình tự nucleotide khác cần thiết cho sự biểu hiện của gen, chẳnghạn như: RBS (ribosome binding sites-vùng liên kết với ribosome để dịch mã). Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thật thuận tiện với các mục đích sử dụng khácnhau. Không có vector toàn năng cho chuyển gen, mà cần có sự chọn lựa tùy mục đích và kích thước củađoạn gen được tạo dòng. Chúng được thiết kế với nhiều chức năng chuyên biệt để mang được các trình tựnucleotide như mong muốn. Các vector chuyển gen có năm ứng dụng quan trọng chủ yếu: - Tạo dòng (cloning) và khuếch đại (amplification) một đoạn trình tự của DNA (nhiều bản sao giốngnhau). - Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA. - Đưa gen vào các tế bào vi sinh vật hay các động-thực vật . - Sản xuất RNA. - Sản xuất protein từ gen được tạo dòng. Chương này giới thiệu sáu loại vector phổ biến (thuộc ba nhóm vector: plasmid, phage/phagemid vànhiễm sắc thể nhân tạo) dùng trong tạo dòng gen (gene cloning): plasmid, bacteriophage λ , cosmid,bacteriophage M13, BAC và YAC.I. Plasmid vector1. Đặc điểm của plasmid Plasmid là các thông tin di truyền ngoài nhân, được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau.Chúng là những phân tử DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước từ 1- ³ 200 kb, có khả năng tự sao chép đểtồn tại độc lập trong tế bào. Các plasmid có thể mang một số gen của vi khuẩn và các gen này có thể biểuhiện ra protein. Một số kiểu hình khác nhau của plasmid như: - Kháng các chất kháng sinh - Kháng kim loại nặng - Sản xuất các chất kháng sinh - Thủy phân các hợp chất hữu cơ phức tạp - Sản xuất độc tố đường ruột enterotoxin - Sản xuất chất diệt khuẩn bacteriocin - Sản xuất các colicin1 - Sản xuất haemolysin2 - Sản xuất các enzyme sửa đổi3 và enzyme hạn chế 4. Một loại vi khuẩn vật chủ thường chứa hai hoặc nhiều loại plasmid cùng tồn tại. Chúng có thể là cácplasmid tương hợp (compatible plasmid) hoặc không tương hợp (incompatible plasmid). Người ta có thểchia plasmid làm hai loại dựa trên đặc điểm sinh sản và phương thức sống của chúng, đó là: plasmid tiếphợp (conjugative plasmid) và plasmid không tiếp hợp (non-conjugative plasmid). Trong tự nhiên, plasmid xâm nhập vào tế bào vật chủ nhờ sự tiếp hợp (conjugation) của vi khuẩn,nhưng trong nghiên cứu thực nghiệm các plasmid được chuyển nạp vào vi khuẩn bằng một quy trình nhântạo gọi là biến nạp gen (gene transformation). Kiểu hình mới của thể nhận (recipient) do plasmid đem đến(Ví dụ: plasmid kháng kháng sinh) cho phép chọn lọc xác định các nhân tố biến nạp và duy trì plasmidtrong quần thể vi khuẩn. Ở các vị trí cắt hạn chế của plasmid, DNA ngoại lai (foreign DNA) có thể chènvào và được xác định với gen mã hóa cho các marker chọn lọc. Một trong các v ector hay được sử dụngtrước đây là pBR 322 mang hai gen kháng ampicillin (Ampr) và tetracycline (Tetr) cùng một số vị trí cắthạn chế thuận lợi. Có hai dạng phân chia từ pBR 322 thích hợp cho sự tái bản là các vector pAT 153 vàpXf 3. Các plasmid kích thước nhỏ có số lượng bản sao lớn hơn và mẫn cảm hơn với vi khuẩn. Tuy nhiên,việc giảm kích thước của plasmid có thể làm mất các vị trí tạo dòng (multiple cloning sites, MCS) hữu ích.Ví dụ: pXf 3 thiếu các vị trí BalI và AvaI (các vị trí này có trong pBR 322 và pAT 153). Một số plasmid không được sử dụng rộng rãi như pBR 322, mà chỉ được sử dụng trong các mục đíchđặc bi ...