Chương 4: PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THỐNG

Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy được xây dựng và phát triển trong thời gian dài, được nhiều nước công nhận và chúng đã trở thành những phương pháp tiêu chuẩn. Tuy vậy nhược điểm lớn nhất của phương pháp nuôi cấy là tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm, mất nhiều công sức, cồng kềnh và ngày càng tỏ ra không đáp ứng được các yêu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện nay. Để khắc phục những nhược điểm trên của phương pháp nuôi cấy, nhiều phương pháp nhanh và...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 4: PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THỐNG Chương 4 PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THỐNG Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi c ấy được xây d ựng và phát tri ển trong th ờigian dài, được nhiều nước công nhận và chúng đã trở thành những ph ương pháp tiêu chu ẩn. Tuyvậy nhược điểm lớn nhất của phương pháp nuôi cấy là tốn nhiều thời gian, cho kết qu ả ch ậm,mất nhiều công sức, cồng kềnh và ngày càng tỏ ra không đáp ứng đ ược các yêu c ầu phân tíchphục vụ nhu cầu thực tế hiện nay. Để khắc phục những nhược đi ểm trên c ủa ph ương phápnuôi cấy, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được hình thành và phát tri ển d ựa trên nhi ềunguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau. Các ph ương pháp m ới này nh ằm m ục đích rútngắn thời gian phân tích, giảm thiểu sự phức tạp trong thao tác, dễ dàng th ực hi ện và có đ ộnhạy và độ chính xác cao. Các phương pháp nhanh và tự động hoá trong phân tích vi sinh vật th ực ph ẩm đ ều d ựa trênnguyên tắc của vi sinh học, sinh hoá học, hoá lý, mi ễn d ịch h ọc, sinh h ọc phân t ử h ọc đ ể pháthiện và định lượng vi sinh vật mục tiêu hay sản phẩm độc hại c ủa chúng trong th ực ph ẩm, môitrường. Tất cả các yêu cầu kỹ thuật liên quan đến việc thu và chuẩn b ị m ẫu, phân tích … đ ềuđược nghiên cứu cải tiến theo hướng tự động hoá, đơn gi ản hoá cho k ết qu ả nhanh và chínhxác.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP Phân tử Adenosine triphosphate (ATP) có mặt trong tất cả các tế bào sống, nên s ự pháthiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn t ại. ATP có thể được phát hiện vàđịnh lượng thông qua cường độ ánh sáng phát ra do sự kết hợp với enzyme Luciferase . Kĩ thuậtnày có thể phát hiện được 1pg ATP, tương ứng với kho ảng 1000 t ế bào vi khu ẩn (10 -15g ATP/tế bào). Quá trình phân tích chỉ diễn ra trong vài phút và vì thế phương pháp này được xem lànhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc. Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác định rõ số vi sinh vật đang hiện diện đãđược biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều sự cải tiến trong vi ệcthiết kế thiết bị đo cường độ ánh sáng phát ra và những hóa chất đ ể ổn đ ịnh s ự phát sáng. Ngàynay phương pháp này được ứng dụng trong 3 lĩnh vực: giám sát v ệ sinh, ki ểm tra nh ững lo ạichất lỏng như nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá ch ất l ượng vi sinh c ủa th ực ph ẩm . Đểđánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm thì lượng ATP c ủa vi sinh v ật ph ải đ ược đo và đi ềunày đòi hỏi những quy trình tách chiết ATP ra khỏi tế bào vi sinh vật. Phản ứng phát sáng sinh học trải qua hai giai đoạn : Mg2+ E + LH2 + ATP E – LH2 AMP + PPi (1) E – LH2 AMP +O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (2) Phản ứng phát sáng sinh học ở đom đóm có thể viết lại như sau: Mg2+ E + LH2 + ATP +O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv +PPi E : luciferase LH2 :luciferin Anh sáng phát ra có bước sóng 562nm, có màu vàng. Mẫu được lấy bằng cách quét những vi sinh vật ở trên bề mặt dụng cụ và thi ết b ị, sau đóđo lượng ATP thông qua một loạt quá trình ly trích. Những thi ết b ị đ ược ch ế tạo đ ầu tiên đòihỏi người thực hiện quét mẫu trên một vị trí (thường là 10cm 2), sau đó nhúng hoàn toàn que quétmẫu vào trong dung dịch chứa những tác nhân làm phóng thích ATP, tr ộn v ới dung d ịchluciferase – luciferin và đặt vào trong một cuvette để đọc trị số ánh sáng. 39 Sơ đồ các bước định lượng nhanh vi sinh vật hiện diện trên bề mặt bằng phản ứng phát sáng2. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến bộ của khoa học trong những năm gần đây đã thúc đẩy s ự phát tri ển c ủa cáckỹ thuật chẩn đoán bằng huyết thanh. Các phương pháp này tỏ ra rất hi ệu qu ả trong vi ệc ch ẩnđoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây b ệnh. Ngày nay ph ương pháp này còn đ ược pháttriển để xác định các chất độc hại trong môi trường nh ư đ ộc t ố, d ư l ượng kháng sinh… Nguyêntắc của phương pháp ELISA dựa trên phản ứng kết hợp gi ữa kháng nguyên v ới m ột kháng th ểđặc hiệu. Phản ứng miễn dịch xãy ra được phát hiện bằng cách sử dụng nh ững kháng th ể đãđược đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ, hay enzyme). Phương pháp ELISA là phương pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linkedimmunosorbent assay). Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng th ể đ ơn dòng (kháng th ểsơ cấy) phủ bên ngoài những giếng (well) nhỏ nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên mụctiêu. Những kháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể th ứ hai có gắnvới enzyme phát tính hiệu (thường là horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase). Khi chovào hỗn hợp phản ứn ...