Chương 5: Tạo dòng genomic DNA của eukaryote và xây dựng thư viện genomic DNA

Thư viện genomic DNA là một tập hợp các đoạn DNA cùng đại diện cho một genome nguyên vẹn (hoặc gần nguyên vẹn) của cá thể mà DNA được bắt nguồn từ đó. Các đoạn này nằm trong các vector tự sao chép cho phép chúng được duy trì và sinh sản cùng với tế bào của cơ thể vi sinh vật, như vi khuẩn Escherichia coli hoặc nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
Chương 5: Tạo dòng genomic DNA của eukaryote và xây dựng thư viện genomic DNA Chương 5 Tạo dòng genomic DNA của eukaryote và xây dựng thư viện genomic DNA Thư viện genomic DNA là một tập hợp các đoạn DNA cùng đại diện cho một genome nguyên vẹn(hoặc gần nguyên vẹn) của cá thể mà DNA được bắt nguồn từ đó. Các đoạn này nằm trong các vector tựsao chép cho phép chúng được duy trì và sinh sản cùng với tế bào của cơ thể vi sinh vật, như vi khuẩnEscherichia coli hoặc nấm men Saccharomyces cerevisiae. Những thư viện như thế có thể bảo quản nhưlà một nguồn cố định của các đoạn DNA đại diện cho một cơ thể đặc biệt. Một phòng thí nghiệm này cóthể thu thập thư viện genome từ một phòng thí nghiệm khác hoặc từ một nguồn thương mại như là mộtcách lựa chọn để xây dựng thư viện riêng của mình. Một khi thu được, các thư viện được dùng chủ yếu hoặc để sàng lọc theo các phương pháp khácnhau nhằm phân lập một (các) trình tự nucleotide quan tâm đặc biệt, hoặc để xác định vị trí và thứ tự củacác trình tự trong genome mà từ đó thư viện được xây dựng (physical mapping). Xây dựng một thư viện genomic DNA bao gồm bốn giai đoạn chính (Hình 5.1): Cắt DNA, gắn DNAvào vector, đóng gói các dòng tái tổ hợp trong vỏ protein của virus để làm bước trung gian trước khi xâmnhiễm vào tế bào vật chủ, và chuyển cấu trúc đó vào tế bào vật chủ.I. Cắt genomic DNA bằng các enzyme hạn chế Để đưa toàn bộ các gen của genome vào một thư viện, trước hết genome phải được cắt bởi enzymehạn chế thành các đoạn DNA có kích thước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng. GenomicDNA thường được cắt bằng enzyme hạn chế có trình tự nhận biết 4 bp, ví dụ như MboI nhận biết trình tự5’-GATC-3’ . Tuy nhiên, không phải dễ dàng thu được một gen nguyên vẹn nằm trên một đoạn DNA.Trong thực tế, một gen thường bị cắt thành nhiều đoạn DNA do vị trí nhận biết của enzyme nằm ngaytrong gen.Hình 5.1. Xây dựng thư viện genomic DNA. Các giai đoạn trong xây dựng thư viện DNA trong vectorbacteriophage l . a, b, c và d trình bày sự khác nhau (nhưng chồng lên nhau) của các đoạn DNA tronggenome, được hợp nhất trong các vector riêng rẽ và đại diện như là các dòng riêng biệt trong một thưviện. Thông thường, một phản ứng cắt từng phần genomic DNA được tiến hành bằng cách dùng mộtlượng tối thiểu enzyme và ủ trong một thời gian ngắn sao cho mọi vị trí nhận biết không bị cắt đồng thời .Do các vị trí cắt được phân bố ngẫu nhiên nên một gen vẫn có thể được bảo toàn nguyên vẹn ngay khi nóchứa vị trí nhận biết trong gen. DNA sau đó được phân đoạn và chỉ có các đoạn có kích thước nằm trongphạm vi mong muốn được chọn lọc. Các đoạn DNA được đưa vào vector thích hợp. Tập hợp các vectorchứa các đoạn genomic DNA tạo thành thư viện genomic DNA. Mỗi đoạn DNA chứa trong vector củathư viện được gọi là một dòng (clone). Tùy thuộc vào kích thước của các đoạn DNA mà chọn vector làphage (có thể chứa đoạn DNA dài từ 15-23 kb), cosmid (45 kb) hay BAC (>100 kb). Có thể sử dụng DNA tách từ các mô khác nhau để xây dựng thư viện genomic DNA. Các thư việngenomic DNA của một cơ thể chỉ chứa các đoạn DNA dài ngắn khác nhau nhưng thông tin di truyềnkhông thay đổi. Ngược lại, thư viện cDNA được xây dựng từ các mRNA. Trong cơ thể có những gen chỉhoạt động trong những loại tế bào nhất định, do đó giữa các mô khác nhau có thể thu được các phân tửmRNA khác nhau. Vì vậy, một cơ thể có nhiều thư viện cDNA khác nhau đặc trưng cho từng loại tổ chứcchuyên hóa (xem chương 6).II. Tạo dòng các đoạn DNA để xây dựng thư viện genome Các đoạn DNA thu được từ phản ứng cắt hạn chế được gắn đồng hóa trị in vitro vào vector tạodòng bằng cách dùng enzyme DNA ligase. Trước khi gắn, vector được cắt ra ở một vị trí đơn, thôngthường là cùng với enzyme được dùng để cắt DNA nguồn, nhằm tạo các đầu kết dính bổ trợ cho các đầucủa các đoạn chèn DNA. Một đôi khi, vector và DNA nguồn được cắt với tổ hợp hai enzyme khác nhauđể ngăn cản mỗi loại phân tử tự gắn lại. Sự tự tái tạo lại vòng của vector cũng có thể giảm thiểu bằng cáchxử lý với enzyme alkaline phosphatase để loại nhóm 5’ phosphate khỏi các đầu của vector. Một số lượng lớn các vector tạo dòng được phát triển cho việc xây dựng các thư viện DNA, chọnlựa vector nào phụ thuộc vào phạm vi kích thước của các đoạn DNA được tạo dòng, và các ứng dụng tiếptheo.1. Các plasmid vector Các plasmid là các phân tử DNA mạch vòng đóng cộng hóa trị, siêu xoắn và có kích thước vàikilobase (chương 4). Mặc dù các plasmid xuất hiện tự nhiên, chủ yếu ở vi khuẩn, nhưng những plasmiddùng trong xây dựng các thư viện DNA thường được thiết kế có chủ định với các cấu trúc nhân tạo. Cácvector tạo dòng này chứa các vị trí nhận biết đơn cho một enzyme hạn chế mà tại đó các DNA ngoại laicó thể được chèn vào (insertion). Các vị trí cho nhiều enzyme khác nhau có thể được tập hợp lại trongvùng tạo dòng (multiple cloning sites) hoặc vùng đa nối (polylin ...