chương V. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN

Ứng dụng tế bào trần• Có khả năng tiếp nhận vật liệu “ngoại lai”: nhân, ti thể, lục lạp, plasmids, vi khuẩn và virus • Có khả năng tái sinh vách tế bào  Đối tượng lai tạo giống: lai cùng loài, lai khác loài, lai khác giới sinh vật.Ứng dụng tế bào trần• Nghiên cứu sự tổng hợp và phân hủy vách tế bàoNuôi cấy tế bào trần1) 2) 3) 4) 5) 6) Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy; Xử lý enzyme tạo tế bào trần; Tách tế bào trần; Xác định mật độ tế bào trần;...
Nội dung trích xuất từ tài liệu:
chương V. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN 3/24/2011 CHƢƠNG V. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN Ứng dụng tế bào trần Khái niệm tế bào trần • Có khả năng tiếp nhận vật liệu “ngoại Tế bào trần (Protoplast) = tế bào lai”: nhân, ti thể, lục lạp, plasmids, vi đơn – vách khuẩn và virus • Có khả năng tái sinh vách tế bào  Đối tượng lai tạo giống: lai cùng loài, lai khác loài, lai khác giới sinh vật. Ứng dụng tế bào trần Nuôi cấy tế bào trần• Nghiên cứu sự tổng hợp và phân 1) Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy; hủy vách tế bào 2) Xử lý enzyme tạo tế bào trần; 3) Tách tế bào trần; 4) Xác định mật độ tế bào trần;• Nghiên cứu hệ 5) (Dung hợp tế bào trần) thống tế bào đơn 6) Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần. 1 3/24/2011 2) Xử lý enzyme 1) Chọn và khử trùng mẫu cấy • Xử lý cơ học Khử trùng Xử lý thẩm thấu bằng manitol hay sorbitol 2) Xử lý enzyme • Xử lý enzyme cellulase, hemi-cellulase, pectinase, lignase 3) Tách tế bào trần 4) Xác định mật độ • Nhuộm bằng phẩm nhuộm fluorescein diacetate để đánh giá khả năng sống sót của protoplast3) Tách tế bào trần 2 3/24/2011 4) Xác định mật độ • Đếm trên buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ 6) Nuôi cấy và tái sinh5) Dung hợp tế bào trần tế bào trần • Môi trường nuôi cấy thường chứa 13% manitol, auxin, cytokinin,… • Tái tạo vách tế bào • Phân chia tạo cụm tế bàoDung hợp tế bào trần và Dung hợp tế bào trần và sự lai vô tính sự lai vô tính Nếu như những tế bào trần được cô lập Các tế bào trần có thể dung hợp từ các nguồn tế bào khác nhau mà được xửmột cách tự nhiên trong quá trình cô lý để dung hợp thì gọi là lai vô tính.lập 3 3/24/2011 Phương pháp dung hợp tế 1) Phương pháp xử lý cơ học bào trần • Tế bào trần cô lập được gom lại cho nằm 1) Phương pháp xử lý cơ học gần với nhau nhờ một dụng cụ cầm tay cực 2) Phương pháp xử lý bằng nitrate sodium nhỏ và một micropipette. • Một phần của đầu micropipette được chận 3) Phương pháp xử lý bằng ion Ca2+ (pH lại vì vậy các tế bào trần được giữ lại và cao) được đẩy đi theo dòng chất lỏng. 4) Phương pháp xử lý bằng Polyethylene • Số lượng tế bào dung hợp nhờ phương Glycol (PEG) pháp này rất thấp và vì vậy phương pháp 5) Phương pháp dung hợp bằng xung điện này không thông dụng. 2) Phương pháp xử lý bằng 3) Phương pháp xử lý bằng nitrate sodium ion Ca2+ (pH cao) • Tế bào trần được ly tâm trong 3 phút ở• Tế bào trần cô lập được đặt trong hỗn hợp NaNO3 5,5% trong dung dịch sucrose 10%. Giữ tốc độ 50 vòng/phút trong môi trường ổn định trong nước ở 35ºC và sau đó đem đi ly cảm ứng sự dung hợp gồm có 0,5M tâm 200 vòng trong 5 phút. manitol, 0,05M CaCl2.2H2O ở pH 10,5.• Loại bỏ phần nổi và cho các cụm tế bào vào nước • Các ống ly tâm có chứa tế bào trần được trong 30 phút. Trong suốt quá trình này, hầu ngâm trong nước ở 37ºC trong 40-50 hết các tế bào trần sẽ tiến hành dung hợp. Các ...